猪圆环病毒2型（PCV2）LAMP现场可视化定性快速检测试剂盒药证申报的前期研究

发布时间：2021-05-11 10:09

　　猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是单股负链DNA病毒,直径约17 nm,是现阶段最小的动物病毒。由PCV2病毒引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征（Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS）发病迅速,流传广泛,病猪难以治愈且死亡率高,对国内乃至全世界的养猪业危害极大。PCV2常常与某些病毒混合感染,如猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、弓形体、附红细胞体等,可促进相关疾病的发作。PMWS典型症状包括进行性消瘦,呼吸困难,厌食,精神不振,毛发蓬乱,黄疸等。肉眼检查肠系膜及腹股沟淋巴异常肿大和肺部灰褐色炎症病变最常见,其它一些器官如肝、脾、胰、胃、小肠和结肠也常见肿大及坏死病变。由于PCV2严重破坏猪的免疫系统,引起免疫力低下,一旦猪体内存在其他病毒或细菌、原虫感染,就会暴发流行,目前该病已广泛流行于美国、法国、中国、韩国等国家,给世界各国养猪业造成的损失巨大。目前,PCV2的诊断主要依靠免疫学检测技术和分子生物学检测技术。但是这些检测方法普遍存在一定的局限性,灵敏度低、成本高、操作过程复杂等因... 

【文章来源】：上海师范大学上海市

【文章页数】：67 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 猪流行性病毒简介
    1.2 四种主要流行病毒的症状和危害
        1.2.1 猪瘟病毒
        1.2.2 猪伪狂犬病病毒
        1.2.3 猪繁殖与呼吸综合症病毒
        1.2.4 猪圆环病毒病
    1.3 猪圆环病毒2型背景知识
    1.4 猪圆环病毒2型的传播
    1.5 常规分子生物学检测技术
        1.5.1 PCR检测技术
        1.5.2 ELISA检测技术
        1.5.3 基因芯片
    1.6 环介导等温扩增检测方法发展及展望
    1.7 研究的目的和意义
    1.8 创新点
    1.9 技术路线
第二章 猪圆环病毒2型(PCV2)LAMP现场可视化快速检测试剂盒主要原材料的研究
    2.1 材料
        2.1.1 材料来源
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 PCV2靶基因序列的选择
        2.1.5 引物设计
    2.2 方法
        2.2.1 猪圆环病毒2型DNA的提取
        2.2.2 PCR反应体系
        2.2.3 PCR产物的克隆与测序
            2.2.3.1 胶回收
            2.2.3.2 胶回收产物检测
            2.2.3.3 连接
            2.2.3.4 转化
            2.2.3.5 PCR方法鉴定阳性克隆
            2.2.3.6 阳性克隆菌液扩大培养
            2.2.3.7 测序
        2.2.4 试剂盒标准品阳性质粒模板的制备
        2.2.5 PCV2 LAMP检测试剂盒样品模板的制备
        2.2.6 PCV2 LAMP检测试剂盒的组装和使用
        2.2.7 试剂盒标准阳性对照的制备
        2.2.8 空白对照制备
        2.2.9 Bst酶和LAMP反应缓冲液的比对研究
        2.2.10 Bst酶和LAMP反应缓冲液质量鉴定研究
        2.2.11 试剂盒阴性参考品和阳性参考品的制备与试验
    2.3 结果与分析
        2.3.1 PCV2的PCR产物检测
        2.3.2 PCR产物的克隆与测序检测
            2.3.2.1 PCR胶回收产物
            2.3.2.2 克隆产物的检测
            2.3.2.3 测序结果
        2.3.3 PCV2 LAMP检测试剂盒的组装和使用
        2.3.4 试剂盒标准阳性对照的制备
        2.3.5 Bst酶和LAMP反应缓冲液的比对研究
        2.3.6 Bst酶和LAMP反应缓冲液质量鉴定研究
        2.3.7 试剂盒阳性参考品研究
        2.3.8 试剂盒阴性参考品研究
    2.4 讨论
第三章 猪圆环病毒2型(PCV2)LAMP现场可视化快速检测试剂盒工艺及反应体系的研究
    3.1 材料
        3.1.1 材料来源
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要仪器
    3.2 方法
        3.2.1 试剂盒标准品阳性质粒模板的制备
        3.2.2 PCV2 LAMP检测试剂盒样品模板的制备
        3.2.3 PCV2 LAMP检测试剂盒的组装和使用
        3.2.4 试剂盒标准阳性对照的制备
        3.2.5 空白对照制备
        3.2.6 样本储存时间研究
        3.2.7 样本冻融次数研究
        3.2.8 样本运输储存时间研究
        3.2.9 试剂用量研究
        3.2.10 温度影响研究
        3.2.11 阳性对照分装环境研究
        3.2.12 确定试剂盒临界值研究
        3.2.13 猪圆环病毒2型LAMP检测试剂盒的特异性研究
        3.2.14 生产过程质控点的设置
    3.3 结果与分析
        3.3.1 PCV2 LAMP检测试剂盒的组装和使用
        3.3.2 试剂盒标准阳性对照的制备
        3.3.3 样本储存时间研究
        3.3.4 样本冻融次数研究
        3.3.5 样本运输储存时间研究
        3.3.6 试剂用量研究
        3.3.7 温度影响研究
        3.3.8 阳性对照分装环境研究
        3.3.9 确定试剂盒临界值研究
        3.3.10 试剂盒特异性实验
        3.3.11 生产过程质控点的设置
    3.4 讨论
第四章 猪圆环病毒2型(PCV2)LAMP现场可视化快速检测试剂盒分析性能研究
    4.1 材料
        4.1.1 材料来源
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 主要仪器
    4.2 方法
        4.2.1 试剂盒标准品阳性质粒模板的制备
        4.2.2 PCV2 LAMP检测试剂盒样品模板的制备
        4.2.3 PCV2 LAMP检测试剂盒的组装和使用
        4.2.4 试剂盒标准阳性对照的制备
        4.2.5 空白对照制备
        4.2.6 灵敏度评价
        4.2.7 特异性评估
        4.2.8 准确性评估
        4.2.9 样本基质的干扰实验
        4.2.10 药物的干扰试验
    4.3 结果与分析
        4.3.1 PCV2 LAMP检测试剂盒的组装和使用
        4.3.2 试剂盒标准阳性对照的制备
        4.3.3 灵敏度评价
        4.3.4 特异性评估
        4.3.5 准确性评估
        4.3.6 样本基质的干扰实验
        4.3.7 药物的干扰实验
    4.4 讨论
第五章 全文总结
参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]猪圆环病毒2型Cap基因多拷贝质粒的构建及病毒样颗粒的表达[J]. 尹曼曼,刘汉平,楼觉人.  动物医学进展. 2019(09)
[2]CSFV、PRRSV和PCV2多重PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 兰世捷,陈亮,苗艳,冯万宇,王志强,朱庆贺,金振华,李阳,徐馨,李丹.  中国猪业. 2019(06)
[3]猪伪狂犬病病毒检测基因芯片的构建[J]. 吴凤笋,吕玉金,刘玲玲,刘胜利,张中华,柳增善.  畜牧与兽医. 2018(10)
[4]GST pull-down结合质谱筛选猪圆环病毒2型ORF4潜在互作蛋白[J]. 林翠,唐雯,顾金燕,金玉兰,董伟仁,廖敏,周继勇.  生物工程学报. 2019(01)
[5]猪圆环病毒3型LAMP检测方法的建立与应用[J]. 姜辰龙,严秀文,张日腾,李勇,姜平,白娟.  畜牧兽医学报. 2018(06)
[6]猪圆环病毒2型天津及周边地区分离株的遗传演化分析[J]. 王利丽,郑丽,路超,任卫科,张莉,李富强,鄢明华.  中国畜牧兽医. 2018(05)
[7]猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）协同感染细菌性疾病的分析研究[J]. 李明波,库旭钢,赵海忠,宋忠旭,孙华,梅书棋.  中国畜牧兽医. 2018(03)
[8]表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株的构建与鉴定[J]. 张玲楷,李永锋,谢利豹,孙元,王晓,仇华吉.  生物工程学报. 2018(02)
[9]猪圆环病毒Ⅱ型可视化LAMP检测方法的应用[J]. 许宗丽,黄溢泓,李志源,周师师,覃艳然,邱洁,盘美妮,刘针伶.  养殖与饲料. 2017(11)
[10]基因芯片技术及其在畜牧兽医业中的应用概述[J]. 陆曼,李博岩,王旭平,柳诚刚,谭斌,杨汝才.  生物学教学. 2017(09)

硕士论文
[1]种猪群猪圆环病毒病的净化技术研究[D]. 管亮.安徽农业大学 2014
[2]同时检测猪瘟和北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的复合荧光定量RT-PCR方法的建立[D]. 成丹.新疆农业大学 2008



本文编号：3181222