大熊猫IFN-γ聚氰基丙烯酸正丁酯纳米球的制备

发布时间：2017-04-20 15:14

  本文关键词：大熊猫IFN-γ聚氰基丙烯酸正丁酯纳米球的制备，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：大熊猫(Ailuropoda melanoleuca),我国特有珍稀野生动物,属国家一级濒危保护物种。随着近年来圈养大熊猫的增多,增加了熊猫与人类“亲密接触”的机会,使得大熊猫疫病的流行背景变得愈加复杂,病毒性疾病发病率逐渐上升。干扰素γ(Interferon-gamma, IFN-γ)是细胞因子家族的重要成员,主要由自然杀伤细胞(NK细胞)和T细胞分泌,是Ⅱ型免疫干扰素的唯一成员。干扰素γ能够调节巨噬细胞、T/B细胞间的关系,增强免疫应答,还具有抗病毒、抗肿瘤等多种生物学活性；广泛应用于多种疾病的预防和治疗。但其在体内半衰期短、易发生酶解,需频繁给药。高分子纳米载药系统是近几十年研发的新型给药系统,既可以增加药物的穿透力、靶向性和稳定性,又能保护蛋白类药物免遭破坏,延长药效。其中聚氰基丙烯酸正丁酯(Polybutylcyanoacrylate, PBCA)是一种极富潜力的纳米载药材料,拥有良好的生物相容性和可降解性,没有免疫原性,安全性高。本试验选取PBCA作为载体材料,大熊猫干扰素γ为药物模型,制备纳米球(IFNy-PBCA-NS),以期优选出最佳的制作工艺,为进一步研究包封大熊猫多肽类药物微粒提供参考依据,为大熊猫疾病诊疗提供新的思路,主要结果如下：1.本试验从刀豆凝集素A诱导的大熊猫外周血淋巴细胞中提取总RNA,成功扩增出大熊猫IFN-y基因。结果显示所得IFN-y基因共465 bp,与GenBank中的大熊猫IFN-y基因相比较,匹配率达96%-99%,没有缺失变异等情况。再将测序成功的产物连接到原核表达载体上,利用大肠杆菌系统进行培养。经IPTG诱导的重组蛋白约33.5 kD,主要以包涵体的形式存在。采用Ni柱亲和层析柱纯化蛋白,并梯度透析复性,经核酸蛋白酶仪测定,蛋白浓度为0.46 mg/mL。采用VSV-WISH系统测定干扰素的抗病毒活性,结果为3.2×105U/mg。2.采用乳化聚合法制备IFNy-PBCA-NS结果显示,所得纳米球为骨架型纳米球,经电镜观察纳米球外观规整,粒径在50 nm～200 nm之间,跨距0.55,大小较均匀,包封率为56.7%,载药量为0.86%。在优化纳米球制备条件试验中,确定pH值6-6.5、BCA用量5-10 g/L、poloxamer188用量5～10 g/L、IFN-γ用量小于0.8 g/L的条件范围内均有利于纳米球的制备,不易出现粘连、分散不均等情况。小鼠药效试验结果表明,sc-IFNy-PBCA-NS组生命延长率(RLML)最显著,IFNγ-PBCA-NS组整体效果优于IFN-y组。SPSS软件方差分析,可得ig-IFN-y组与ig-IFNy-PBCA组的RLML差异极显著(P0.01)；sc-IFN-γ组与sc-IFNγ-PBCA组RLML差异显著(P0.05)。说明包被后的IFN-γ在体内抗病毒作用增强,采用PBCA为载药材料制备的大熊猫IFN-γ纳米球具有一定的缓释作用。
【关键词】：大熊猫 干扰素γ 原核表达 聚氰基丙烯酸正丁酯 纳米球
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S859.79
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 符号说明8-12
• 第一章 文献综述12-27
• 1 大熊猫疾病研究概况12-13
• 1.1 病毒性疾病12-13
• 1.2 寄生虫疾病13
• 2 干扰素研究概况13-21
• 2.1 干扰素的发现14
• 2.2 干扰素γ的产生与结构14-15
• 2.3 干扰素γ的受体及信号传导15-16
• 2.4 干扰素γ的主要生物活性16-19
• 2.4.1 抗病毒作用16-17
• 2.4.2 抗肿瘤作用17-18
• 2.4.3 免疫调节作用18
• 2.4.4 抗寄生虫作用18-19
• 2.5 长效干扰素的研究情况19-21
• 2.5.1 PFG修饰19
• 2.5.2 定点突变技术19-20
• 2.5.3 糖基化修饰20
• 2.5.4 融合蛋白20
• 2.5.5 缓释系统20-21
• 3 PBCA-NS载药系统研究概况21-26
• 3.1 制作工艺22-23
• 3.1.1 乳化聚合法22
• 3.1.2 界面聚合法22-23
• 3.1.3 纳米沉淀法23
• 3.1.4 嵌段共聚物合成法23
• 3.2 PBCA-NS载药系统的应用23-25
• 3.2.1 脑靶向性23-24
• 3.2.2 肝靶向性24
• 3.2.3 骨髓靶向性24-25
• 3.2.4 其他靶向性25
• 3.3 毒理学研究25-26
• 4 研究目的和意义26-27
• 第二章 IFNγ的原核表达27-47
• 1 实验材料27-31
• 1.1 载体、菌株和细胞27-28
• 1.2 实验动物28
• 1.3 实验仪器28
• 1.4 试剂与配制28-31
• 2 实验方法31-39
• 2.1 干扰素γ克隆载体的构建31-35
• 2.1.1 引物的设计与合成31
• 2.1.2 大熊猫外周血淋巴细胞的分离31
• 2.1.3 总RNA的提取31-32
• 2.1.4 cDNA的合成32
• 2.1.5 目的基因的扩增与回收纯化32-33
• 2.1.6 克隆载体的连接33
• 2.1.7 质粒的转化33-34
• 2.1.8 重组质粒的鉴定34-35
• 2.2 干扰素γ原核表达载体的构建35-39
• 2.2.1 表达载体的连接35
• 2.2.2 重组质粒的转化35
• 2.2.3 重组表达菌的诱导表达35-36
• 2.2.4 重组蛋白SDS-PAGE检测36
• 2.2.5 原核表达的条件优化36-37
• 2.2.6 重组蛋白可溶性检测37
• 2.2.7 重组蛋白的纯化37-38
• 2.2.8 重组蛋白的浓度与活性测定38
• 2.2.9 重组蛋白的免疫印迹(Western blotting)检测38-39
• 3 结果与分析39-44
• 3.1 干扰素γ克隆载体的构建39-40
• 3.1.1 目的基因的扩增39
• 3.1.2 重组质粒的鉴定39-40
• 3.2 干扰素γ原核表达载体的构建40-44
• 3.2.1 表达载体双酶切鉴定40
• 3.2.2 重组蛋白SDS-PAGE检测结果40-41
• 3.2.3 原核表达的条件优化结果41-43
• 3.2.4 重组蛋白可溶性检测结果43
• 3.2.5 重组蛋白的纯化结果43-44
• 3.2.6 表达蛋白的浓度与活性结果44
• 3.2.7 表达蛋白的免疫印迹(Western blotting)检测结果44
• 4 讨论44-47
• 4.1 原核表达系统44-45
• 4.2 包涵体蛋白的纯化与复性45-47
• 第三章 干扰素γ纳米球的制备47-59
• 1 实验材料47-48
• 1.1 病毒与细胞47
• 1.2 实验动物47
• 1.3 实验仪器47
• 1.4 试剂与配制47-48
• 2 实验方法48-50
• 2.1 纳米球的制备48
• 2.2 纳米球的质量评价48-49
• 2.2.1 纳米球包封率、载药量的测定48-49
• 2.2.2 纳米球表征49
• 2.3 纳米球的药效测定49-50
• 3 结果与分析50-55
• 3.1 IFNγ-PBCA-NS的制备50-51
• 3.2 纳米球的包封率与载药量51-52
• 3.3 纳米球的表征52-53
• 3.4 纳米球药效测定结果53-55
• 4 讨论55-59
• 4.1 大熊猫IFN-γ纳米球的制备情况55-56
• 4.2 纳米球制备的影响因素56-57
• 4.2.1 pH值56
• 4.2.2 稳定剂56-57
• 4.2.3 其他影响因素57
• 4.3 冻干保护剂57
• 4.4 纳米球的表征57-58
• 4.5 纳米球的药效58-59
• 全文总结59-60
• 参考文献60-65
• 致谢65-66
• 附件66

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本文编号：318951