辽宁绒山羊新基因OCIAD2生物学功能研究

发布时间：2017-04-20 16:14

  本文关键词：辽宁绒山羊新基因OCIAD2生物学功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：辽宁绒山羊是我国特有的遗传物种,产绒量居全国之首,被誉为“国宝”,是动物基因保护物种。辽宁绒山羊所产山羊绒是上乘的动物纤维纺织原料,有着非常重要的经济价值。在前期工作中,通过对辽宁绒山羊皮肤组织建库测通获得基因卵巢癌免疫抗原蛋白(OCIAD2)的全长序列。首先对OCIAD2基因利用生物信息学分析其核酸和氨基酸序列,并进行理化性质、疏水性分析、跨膜结构域、磷酸化位点、保守结构域、二级结构预测、信号肽预测分析,以及亚细胞定位并建立进化树。再利用RT-PCR技术检测OCIAD2基因在其它内脏器官中的表达情况,然后利用原位杂交技术检测其特异性表达位点,利用荧光定量PCR技术检测不同生长时期OCIAD2基因在初、次级毛囊中的表达含量。此外,检测Noggin基因干扰后对OCIAD2基因表达的影响。实验结果如下:(1)生物信息学分析显示:该基因能够表达含有154个氨基酸的蛋白质,为亲水性蛋白;二级结构主要以无规卷曲结构(68.18%)为主;该蛋白质为两次跨膜蛋白,含有一个保守的蛋白结构域,存在2个跨膜区域,无信号肽且最有可能定位在细胞核中;辽宁绒山羊OCIAD2基因与家绵羊OCIAD2基因同源性较高。(2)RT-PCR结果显示:OCIAD2基因在心脏、肾脏、脾脏中显著表达,在皮肤中少量表达,在肝脏和肺脏中几乎不表达。(3)原位杂交结果显示:OCIAD2基因在初、次级毛囊的内根鞘均有强烈的表达。在毛囊周围的基质细胞中少量表达,在毛干、外根鞘以及毛囊乳突中无表达。(4)荧光定量PCR结果显示:毛囊在兴盛期时,OCIAD2基因在次级毛囊的表达约为初级毛囊的3.89倍(P0.01),毛囊在退行期时,OCIAD2基因在初级毛囊的表达量约为次级毛囊的1.22倍(P0.01)。(5)Noggin基因敲减后,OCIAD2基因表达量增加,有利于提高绒山羊绒毛品质。由以上结果可以得出以下结论:(1)通过对OCIAD2基因在生物信息学,荧光定量以及原位杂交等方面的研究,推断OCIAD2基因可能对绒的生长起着一定的调控作用。(2)干扰Noggin基因的表达后,OCIAD2基因的表达量上升。这些研究为后续分析OCIAD2基因对辽宁绒山羊绒毛的影响提供重要的实验依据。
【关键词】：辽宁绒山羊 OCIAD2基因 生物信息分析 荧光定量 原位杂交
【学位授予单位】：辽宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S827
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 1 绪论10-15
• 1.1 辽宁绒山羊10
• 1.2 绒山羊国内外研究进展10-11
• 1.3 OCIAD2研究进展11-12
• 1.4 BMP及其介导的BMP信号通路12-13
• 1.4.1 BMP12
• 1.4.2 BMP信号通路12-13
• 1.5 Noggin基因概述13-14
• 1.6 本研究的目的及意义14-15
• 2 辽宁绒山羊OCIAD2基因序列分析15-24
• 2.1 序列来源15
• 2.2 实验方法15
• 2.3 OCIAD2的生物信息学分析15-23
• 2.4 讨论23-24
• 3 辽宁绒山羊OCIAD2基因在不同组织中的表达情况24-30
• 3.1 实验材料24-25
• 3.1.1 实验样本24
• 3.1.2 实验试剂及仪器24-25
• 3.2 实验方法25-27
• 3.2.1 各组织总RNA的提取25
• 3.2.2 各组织总RNA的检测25-26
• 3.2.3 反转录反应26
• 3.2.4 PCR反应26-27
• 3.3 实验结果27-29
• 3.3.1 RNA提取27-28
• 3.3.2 RT-PCR28-29
• 3.4 讨论29-30
• 3.4.1 实验结果讨论29
• 3.4.2 实验注意事项29-30
• 4 辽宁绒山羊OCIAD2基因在皮肤中的定位分析30-37
• 4.1 实验材料30-31
• 4.1.1 实验样本及处理30
• 4.1.2 实验试剂及仪器30-31
• 4.2 实验方法31-33
• 4.2.1 原位杂交相关试剂配方31
• 4.2.2 载玻片的处理31
• 4.2.3 制备皮肤组织石蜡切片31-32
• 4.2.4 探针的制备32
• 4.2.5 原位杂交预处理及探针杂交和检测32-33
• 4.3 实验结果33-36
• 4.3.1 提取RNA结果33
• 4.3.2 原位杂交结果33-36
• 4.4 讨论36-37
• 4.4.1 原位杂交结果讨论36
• 4.4.2 原位杂交注意事项36-37
• 5 辽宁绒山羊OCIAD2基因在初次级毛囊中的定量分析37-43
• 5.1 实验材料37
• 5.1.1 实验样品37
• 5.1.2 实验试剂及仪器37
• 5.2 实验方法37-38
• 5.2.1 初次级毛囊的总RNA提取37
• 5.2.2 反转录反应37
• 5.2.3 Real Time PCR37-38
• 5.3 实验结果38-41
• 5.3.1 RNA提取38-39
• 5.3.2 实时荧光定量39-41
• 5.4 讨论41-43
• 5.4.1 实验结果讨论41
• 5.4.2 实验注意事项41-43
• 6 Noggin基因干扰慢病毒及干扰Noggin基因后OCIAD2基因的表达研究43-53
• 6.1 实验材料43-44
• 6.1.1 实验所用细胞及慢病毒液43
• 6.1.2 实验试剂及仪器43-44
• 6.2 实验方法44-46
• 6.2.1 细胞培养44
• 6.2.2 目的病毒及阴性对照腺病毒感染目的细胞44
• 6.2.3 病毒感染后的细胞中抽提总RNA44
• 6.2.4 RNA反转录成cDNA44-45
• 6.2.5 qPCR引物设计45
• 6.2.6 qPCR实验45-46
• 6.3 实验结果46-52
• 6.3.1 病毒感染前后细胞图片46-48
• 6.3.2 RT-PCR预实验48-49
• 6.3.3 RNA抽提电泳图49-50
• 6.3.4 qPCR数据分析50-52
• 6.4 讨论52-53
• 结论53-54
• 参考文献54-58
• 附录A 原位杂交相关试剂配方58-60
• 附录B 不同时期 β-Actin、OCIAD2基因的扩增曲线和融解曲线图60-63
• 附录C 目的病毒及阴性对照腺病毒感染目的细胞,病毒干扰后的细胞中抽提总RNA63-64
• 致谢64

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