两种温度驯化下松材线虫成虫转录组特征及性别决定基因mog的分析
发布时间：2021-05-21 16:21
松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）引起的松材线虫病是世界性检疫病害,自1982年传入我国,其适生区不断扩展,多样性的寄主植物和媒介昆虫,一定程度上加大了松材线虫病防治的难度。温度作为一个关键环境因子,可以影响松材线虫的生命过程。前期,本实验室已经对在15℃和25℃两种不同温度条件下,松材线虫成虫响应温度的表型开展了部分研究,本研究采用组学测序的方法,探究松材线虫成虫在响应温度时转录水平的变化,尝试针对松材线虫的发育繁殖相关的基因进行筛选分析;并针对松材线虫性别决定基因mog,分析其在不同虫态下、不同温度下的转录差异,并采用RNA干扰的方法,分析其对松材线虫发育繁殖的影响。主要结果如下:1.松材线虫在15℃与25℃两种温度条件下驯化的成虫在转录水平上有明显的差异,与信号转导、脂质代谢以及生殖发育相关的基因在温度响应上表现出典型的差异性特征。松材线虫成虫典型信号路径中具有差异的基因hsp72、cbp-1、unc-68、ctl-2在15℃条件下基因上调表达;松材线虫成虫的脂质代谢途径中相关基因pod-2、alh-12、asm-3、fat-2、fat-7、gpdh...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：111 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
1 引言
1.1 松材线虫及松材线虫病
1.1.1 松材线虫寄主植物及媒介昆虫
1.1.2 松材线虫生活史
1.1.3 松材线虫致病机理
1.1.4 松材线虫及松材线虫病防治措施
1.2 温度影响线虫的生命活动
1.2.1 温度对松材线虫生命活动的影响
1.2.2 温度对其他植物寄生线虫生命活动的影响
1.2.3 线虫具有响应并适应低温的能力
1.3 线虫的发育繁殖
1.3.1 线虫的生殖发育及dauer期线虫形成
1.3.2 线虫的性别决定与性别分化
1.4 本研究的目的和意义
2 试验材料与方法
2.1 材料
2.1.1 菌株与虫株
2.1.2 溶液配制
2.1.3 培养基配制
2.1.4 主要仪器
2.1.5 生化及分子生物学试剂
2.1.6 引物设计与合成
2.2 方法
2.2.1 松材线虫在不同温度环境下的持续驯化培养试验
2.2.1.1 松材线虫虫株的活化
2.2.1.2 松材线虫虫株持续驯化培养
2.2.2 松材线虫的分离、收集、清洗
2.2.2.1 松材线虫的分离
2.2.2.2 松材线虫的收集
2.2.2.3 松材线虫的清洗
2.2.3 松材线虫虫体总RNA的提取
2.2.4 松材线虫虫体总RNA的反转录
2.2.5 松材线虫虫体总RNA转录组分析
2.2.5.1 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫转录组数据可靠性评估
2.2.5.2 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫基因表达水平分析
2.2.5.3 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫基因差异表达分析
2.2.5.4 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫生长发育分析
2.2.6 松材线虫mog基因的分析
2.2.6.1 松材线虫mog基因的碱基序列分析
2.2.6.2 松材线虫mog基因编码的蛋白质结构分析
2.2.6.3 松材线虫mog基因的表达水平分析
2.2.6.4 松材线虫mog基因的功能通路分析
2.2.7 松材线虫RNA干扰所用外源dsRNA合成
2.2.7.1 mog-2和gfp基因特异性片段克隆
2.2.7.2 mog-2和gfp基因特异性片段PCR产物的纯化回收
2.2.7.3 mog-2和gfp基因特异性片段连接表达载体pMD19-T
2.2.7.4 mog-2和gfp重组表达载体转化大肠杆菌DH5α
2.2.7.5 mog-2和gfp重组表达载体转化子的菌液PCR验证
2.2.7.6 mog-2和gfp成功转化的重组表达载体的提取
2.2.7.7 T7-mog-2和T7-gfp特异性片段扩增及载体构建
2.2.7.8 T7-mog-2和T7-gfp特异性片段线性双链DNA扩增及纯化
2.2.7.9 T7-mog-2和T7-gfp特异性片段的dsRNA合成
2.2.8 T7-mog-2和T7-gfp特异性片段DSRNA浸染松材线虫二龄幼虫
2.2.9 外源dsRNA对松材线虫二龄幼虫的影响
2.2.9.1 外源dsRNA能否进入松材线虫二龄幼虫体内并表达
2.2.9.2 外源dsRNA对松材线虫二龄幼虫存活率的影响
2.2.9.3 外源dsRNA对松材线虫二龄幼虫蠕动行为的影响
2.2.9.4 外源dsRNA对松材线虫二龄幼虫取食行为的影响
2.2.9.5 外源dsRNA对松材线虫二龄幼虫发育的影响
3 结果与分析
3.1 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫转录组数据分析
3.1.1 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫转录组数据可靠性分析
3.1.2 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫转录组基因表达水平分析
3.1.3 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫转录组基因差异表达分析
3.1.3.1 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫转录组差异基因GO分析
3.1.3.2 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫转录组差异基因KEGG富集分析
3.1.4 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫信号转导路径分析
3.1.5 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫脂质代谢分析
3.1.6 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫生殖发育基因分析
3.1.6.1 松材线虫daf基因家族分析
3.1.6.2 松材线虫dpy基因家族分析
3.1.6.3 松材线虫HOX基因簇分析
3.1.6.4 松材线虫mog基因家族分析
3.1.6.5 松材线虫性别决定与性别分化基因分析
3.2 松材线虫性别决定基因mog的分析
3.2.1 松材线虫性别决定基因mog的碱基序列分析
3.2.2 松材线虫性别决定基因mog的编码蛋白质结构分析
3.2.2.1 松材线虫MOG蛋白一级结构分析
3.2.2.2 松材线虫MOG蛋白二级结构分析
3.2.2.3 松材线虫MOG蛋白结构域分析
3.2.2.4 松材线虫MOG蛋白3D结构分析
3.2.3 松材线虫mog基因的表达水平分析
3.2.4 松材线虫mog基因的功能通路分析
3.2.5 松材线虫mog-2基因的功能研究
3.2.5.1 松材线虫混合虫态虫体总RNA的提取
3.2.5.2 mog-2和gfp基因特异性片段克隆与重组载体的菌液PCR验证
3.2.5.3 T7-mog-2和T7-gfp特异性片段克隆与重组载体的菌液PCR验证
3.2.5.4 T7-mog-2和T7-gfp特异性片段线性双链DNA扩增
3.2.5.5 T7-mog-2和T7-gfp特异性片段的dsRNA合成
3.2.5.6 外源dsRNA能否进入松材线虫二龄幼虫体内并表达
3.2.5.7 外源dsRNA对松材线虫二龄幼虫存活率的影响
3.2.5.8 外源dsRNA对松材线虫二龄幼虫蠕动行为的影响
3.2.5.9 外源dsRNA对松材线虫二龄幼虫取食行为的影响
3.2.5.10 外源dsRNA对松材线虫二龄幼虫发育的影响
4 讨论
4.1 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫转录组数据分析
4.1.1 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫信号转导路径分析
4.1.2 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫脂质代谢分析
4.1.3 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫生殖发育基因分析
4.2 松材线虫mog基因的分析
5 结论
参考文献
附录
致谢
攻读学位期间发表论文情况
本文编号：3200015
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：111 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
1 引言
1.1 松材线虫及松材线虫病
1.1.1 松材线虫寄主植物及媒介昆虫
1.1.2 松材线虫生活史
1.1.3 松材线虫致病机理
1.1.4 松材线虫及松材线虫病防治措施
1.2 温度影响线虫的生命活动
1.2.1 温度对松材线虫生命活动的影响
1.2.2 温度对其他植物寄生线虫生命活动的影响
1.2.3 线虫具有响应并适应低温的能力
1.3 线虫的发育繁殖
1.3.1 线虫的生殖发育及dauer期线虫形成
1.3.2 线虫的性别决定与性别分化
1.4 本研究的目的和意义
2 试验材料与方法
2.1 材料
2.1.1 菌株与虫株
2.1.2 溶液配制
2.1.3 培养基配制
2.1.4 主要仪器
2.1.5 生化及分子生物学试剂
2.1.6 引物设计与合成
2.2 方法
2.2.1 松材线虫在不同温度环境下的持续驯化培养试验
2.2.1.1 松材线虫虫株的活化
2.2.1.2 松材线虫虫株持续驯化培养
2.2.2 松材线虫的分离、收集、清洗
2.2.2.1 松材线虫的分离
2.2.2.2 松材线虫的收集
2.2.2.3 松材线虫的清洗
2.2.3 松材线虫虫体总RNA的提取
2.2.4 松材线虫虫体总RNA的反转录
2.2.5 松材线虫虫体总RNA转录组分析
2.2.5.1 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫转录组数据可靠性评估
2.2.5.2 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫基因表达水平分析
2.2.5.3 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫基因差异表达分析
2.2.5.4 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫生长发育分析
2.2.6 松材线虫mog基因的分析
2.2.6.1 松材线虫mog基因的碱基序列分析
2.2.6.2 松材线虫mog基因编码的蛋白质结构分析
2.2.6.3 松材线虫mog基因的表达水平分析
2.2.6.4 松材线虫mog基因的功能通路分析
2.2.7 松材线虫RNA干扰所用外源dsRNA合成
2.2.7.1 mog-2和gfp基因特异性片段克隆
2.2.7.2 mog-2和gfp基因特异性片段PCR产物的纯化回收
2.2.7.3 mog-2和gfp基因特异性片段连接表达载体pMD19-T
2.2.7.4 mog-2和gfp重组表达载体转化大肠杆菌DH5α
2.2.7.5 mog-2和gfp重组表达载体转化子的菌液PCR验证
2.2.7.6 mog-2和gfp成功转化的重组表达载体的提取
2.2.7.7 T7-mog-2和T7-gfp特异性片段扩增及载体构建
2.2.7.8 T7-mog-2和T7-gfp特异性片段线性双链DNA扩增及纯化
2.2.7.9 T7-mog-2和T7-gfp特异性片段的dsRNA合成
2.2.8 T7-mog-2和T7-gfp特异性片段DSRNA浸染松材线虫二龄幼虫
2.2.9 外源dsRNA对松材线虫二龄幼虫的影响
2.2.9.1 外源dsRNA能否进入松材线虫二龄幼虫体内并表达
2.2.9.2 外源dsRNA对松材线虫二龄幼虫存活率的影响
2.2.9.3 外源dsRNA对松材线虫二龄幼虫蠕动行为的影响
2.2.9.4 外源dsRNA对松材线虫二龄幼虫取食行为的影响
2.2.9.5 外源dsRNA对松材线虫二龄幼虫发育的影响
3 结果与分析
3.1 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫转录组数据分析
3.1.1 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫转录组数据可靠性分析
3.1.2 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫转录组基因表达水平分析
3.1.3 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫转录组基因差异表达分析
3.1.3.1 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫转录组差异基因GO分析
3.1.3.2 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫转录组差异基因KEGG富集分析
3.1.4 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫信号转导路径分析
3.1.5 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫脂质代谢分析
3.1.6 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫生殖发育基因分析
3.1.6.1 松材线虫daf基因家族分析
3.1.6.2 松材线虫dpy基因家族分析
3.1.6.3 松材线虫HOX基因簇分析
3.1.6.4 松材线虫mog基因家族分析
3.1.6.5 松材线虫性别决定与性别分化基因分析
3.2 松材线虫性别决定基因mog的分析
3.2.1 松材线虫性别决定基因mog的碱基序列分析
3.2.2 松材线虫性别决定基因mog的编码蛋白质结构分析
3.2.2.1 松材线虫MOG蛋白一级结构分析
3.2.2.2 松材线虫MOG蛋白二级结构分析
3.2.2.3 松材线虫MOG蛋白结构域分析
3.2.2.4 松材线虫MOG蛋白3D结构分析
3.2.3 松材线虫mog基因的表达水平分析
3.2.4 松材线虫mog基因的功能通路分析
3.2.5 松材线虫mog-2基因的功能研究
3.2.5.1 松材线虫混合虫态虫体总RNA的提取
3.2.5.2 mog-2和gfp基因特异性片段克隆与重组载体的菌液PCR验证
3.2.5.3 T7-mog-2和T7-gfp特异性片段克隆与重组载体的菌液PCR验证
3.2.5.4 T7-mog-2和T7-gfp特异性片段线性双链DNA扩增
3.2.5.5 T7-mog-2和T7-gfp特异性片段的dsRNA合成
3.2.5.6 外源dsRNA能否进入松材线虫二龄幼虫体内并表达
3.2.5.7 外源dsRNA对松材线虫二龄幼虫存活率的影响
3.2.5.8 外源dsRNA对松材线虫二龄幼虫蠕动行为的影响
3.2.5.9 外源dsRNA对松材线虫二龄幼虫取食行为的影响
3.2.5.10 外源dsRNA对松材线虫二龄幼虫发育的影响
4 讨论
4.1 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫转录组数据分析
4.1.1 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫信号转导路径分析
4.1.2 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫脂质代谢分析
4.1.3 松材线虫15℃和25℃驯化下成虫生殖发育基因分析
4.2 松材线虫mog基因的分析
5 结论
参考文献
附录
致谢
攻读学位期间发表论文情况
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