RRSV在水稻原生质体内的复制与表达

发布时间：2017-04-23 13:07

  本文关键词：RRSV在水稻原生质体内的复制与表达，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)水稻病毒属(Oryzavirus)的成员。RRSV基因组包含10条dsRNA,编码11种蛋白质,其中包括8种结构蛋白和3种非结构蛋白。该病毒引起的水稻齿叶矮缩病在我国南方发病严重,对当地的水稻生产造成严重影响,成为我国水稻生产上的重要病害。本文通过建立水稻原生质体培养体系,制备RRSV抗血清,通过免疫荧光、荧光定量PCR及Western blot检测技术研究RRSV编码3个非结构蛋白(Pns6、Pns7和Pns10)及主要外壳蛋白P8的基因在水稻原生质体内的复制与表达情况。结果表明：(1)通过原核表达制备的抗血清经Western blot和间接ELISA的方法检测证明其可用于病毒检测的应用；(2)通过免疫荧光标记RRSV Pns10,激光共聚焦显微镜观察,发现病毒粒子可以成功侵染水稻原生质体,并可形成类似于病毒原质的组分,该组分随着侵染时间的延长而逐渐发生聚集；(3)利用荧光定量PCR技术,通过对病毒侵染水稻原生质体不同时间段进行动态分析发现,在接种病毒后的60 h内,RRSV各检测基因在8 h时开始积累,后均呈上升趋势,表达非结构蛋白的S6、S7、S1O在24 h左右mRNA表达量达到最大值,表达CP的S8基因在32 h左右增值达到最大值,此后表达量均开始下降,但仍保持在较高水平,该结果表明在病毒侵染水稻原生质体细胞24-32 h时达到复制转录高峰期；(4)以制备的RRSV抗血清为探针,通过Western blot检测到病毒侵染原生质体后,非结构蛋白Pns7和Pns10在12 h开始表达,在32 h左右达到最大值,结构蛋白P8在24 h开始表达,在48 h左右达到最大值,表明非结构蛋白先于外壳蛋白表达,RRSV粒体在侵染水稻原生质体24 h开始增殖,48 h左右达到最大值；(5)通过烟草的瞬时表达体系表达RRSV4个目的基因和YFP的融合蛋白,在激光共聚焦显微镜下观察黄色荧光在烟草细胞中的分布,发现RRSVPns6在细胞膜处,可以形成小颗粒状聚集体,Pns7可能定位在细胞质,P8作为主要外壳蛋白定位在细胞核,Pns10可在细胞内形成大量的颗粒状聚集体,形成类似于病毒原质的颗粒状内含体。
【关键词】：水稻齿叶矮缩病毒 水稻原生质体 抗体制备 基因复制与表达
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S511
【目录】：

• 摘要8-9
• Abstract9-11
• 第一章 前言11-17
• 1.1 水稻齿叶矮缩病毒的研究概况11-14
• 1.1.1 水稻齿叶矮缩病的发生及危害11
• 1.1.2 水稻齿叶矮缩病的传播及症状11-12
• 1.1.3 水稻齿叶矮缩病毒的粒子特性12
• 1.1.4 RRSV的基因组结构12
• 1.1.5 RRSV编码蛋白的功能12-14
• 1.2 植物病毒侵染原生质体的研究概况14-16
• 1.2.1 原生质体在植物病毒研究中的作用14
• 1.2.2 植物病毒复制组装的研究14-15
• 1.2.3 植物病毒在原生质体内的复制和表达研究15-16
• 1.3 本研究的目的和意义16-17
• 第二章 RRSV非结构蛋白及外壳蛋白的原核表达及其抗血清的制备17-30
• 2.1 材料17
• 2.1.1 供试材料17
• 2.1.2 酶和试剂17
• 2.1.3 菌种、载体17
• 2.2 方法17-24
• 2.2.1 引物设计17-18
• 2.2.2 感染RRSV的水稻总RNA的提取18-19
• 2.2.3 目的基因的扩增19-20
• 2.2.4 RRSV目的基因Gateway入门载体的构建20-21
• 2.2.5 RRSV目的基因原核表达载体的构建21-22
• 2.2.6 目的蛋白的诱导表达及检测22
• 2.2.7 抗血清的制备22-23
• 2.2.8 Western blot和间接ELISA检测23-24
• 2.2.9 提纯抗体免疫球蛋白G24
• 2.2.10 荧光抗体的交联24
• 2.3 结果24-29
• 2.3.1 原核表达载体的构建24-26
• 2.3.2 目的蛋白的原核诱导表达26
• 2.3.3 多克隆抗体特异性检测26-27
• 2.3.4 多克隆抗体效价检测27-29
• 2.4 讨论29-30
• 第三章 RRSV在水稻原生质体内的表达动态30-45
• 3.1 材料30
• 3.1.1 供试材料30
• 3.1.2 酶和化学试剂30
• 3.2 方法30-35
• 3.2.1 水稻日本晴品种无菌苗培育30
• 3.2.2 日本晴水稻原生质体的制备30-31
• 3.2.3 原生质体活性的检测31-32
• 3.2.4 RRSV粗提液的提取32
• 3.2.5 RRSV侵染水稻原生质体32
• 3.2.6 不同时间样品RNA的提取32-33
• 3.2.7 cDNA的合成33-34
• 3.2.8 RRSV目的基因标准曲线的建立34
• 3.2.9 Real Time PCR检测不同时间样品中目的基因的表达量34
• 3.2.10 Western blot检测不同时间样品中目的蛋白的表达34
• 3.2.11 免疫荧光标记检测蛋白的表达34-35
• 3.3 结果35-43
• 3.3.1 水稻原生质体的制备及活性检测35
• 3.3.2 原生质体样本总RNA的质量检测35-36
• 3.3.3 实时定量引物扩增效率检测36-40
• 3.3.4 荧光定量PCR检测不同时间样品中目的基因的表达量40-42
• 3.3.5 Western blot检测样品中目的蛋白的表达42
• 3.3.6 免疫荧光标记RRSV在水稻原生质体内的表达42-43
• 3.4 讨论43-45
• 第四章 RRSV非结构蛋白和外壳蛋白的亚细胞定位45-52
• 4.1 材料45-46
• 4.1.1 供试材料45
• 4.1.2 酶和化学试剂45
• 4.1.3 菌种、载体45
• 4.1.4 PCR引物45-46
• 4.2 方法46-47
• 4.2.1 RRSV基因组扩增46
• 4.2.2 RRSV入门载体的构建46
• 4.2.3 入门载体线性化46
• 4.2.4 RRSV植物表达载体的构建46-47
• 4.2.5 RRSV植物表达载体转化农杆菌47
• 4.2.6 诱导农杆菌注射本氏烟47
• 4.3 结果47-50
• 4.3.1 RRSV基因片段的扩增47-48
• 4.3.2 RRSV与pDONOR221入门载体的构建48-49
• 4.3.3 RRSV与植物表达载体pEarleyGate101的构建49
• 4.3.4 病毒基因在本氏烟细胞中的定位49-50
• 4.4 讨论50-52
• 研究总结及展望52-53
• 参考文献53-57
• 附录57-61
• 致谢61

【相似文献】

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 陈晓敏;RRSV在水稻原生质体内的复制与表达[D];福建农林大学;2015年

  本文关键词：RRSV在水稻原生质体内的复制与表达，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：322430