利用Myf5诱导绵羊骨髓间充质干细胞为成肌细胞的研究

发布时间：2017-04-28 02:07

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【摘要】：生肌因子5(Myf5)为生肌决定因子(MyoD)基因家族。MyoD基因家族包括生肌决定因子MyoD肌细胞生成素(Myogenin)、生肌因子5(Myf5)和生肌调节因子4(Mrf4),它们具有单独或协同调节肌细胞的增殖和分化、肌纤维大小和数量等功能。为了建立利用小鼠Myf5基因诱导绵羊骨髓间充质干细胞为成肌细胞的方法,本研究在克隆小鼠Myf5基因的cDNA基础上,依次通过克隆载体pMD18-T Simple和表达载体pcDNA3.1(+)相连,构建真核表达载体pcDNA3.1-Myf5;采用脂质体法将pcDNA3.1-Myf5转染绵羊骨髓间充质干细胞,以观察转染细胞分化形成成肌细胞的能力。其研究结果如下：1.Myf5基因真核表达载体的构建参照GenBank (AK044894)中序列,通过PCR扩增提取小鼠肌肉组织中的总RNA,扩增获得Myf5基因,与克隆载体pMD18-T Simple相连,通过双酶切和测序鉴定后,与表达载体pcDNA3.1(+)表达载体连接。经双酶切鉴定和测序结果显示,与理论序列相符,表明成功获得Myf5基因的真核表达载体pcDNA3.1-Myf5;2.骨髓间充质干细胞转染和分化将冷冻保存的绵羊骨髓间充质干细胞,经复苏后进行传代培养,其结果,培养细胞呈现正常的形态和生长曲线；当传代培养后细胞约达到80%汇合时,分别进行下列处理。A组：转染pcDNA3.1-Myf5无内毒素质粒,并加入含有0.5%DMSO的F12培养基；B组：转染pcDNA3.1-Myf5无内毒素质粒,加入F12培养基；C组：含0.5%DMSO的F12培养基。当转染后第12d开始,在倒置显微镜下,3组转染细胞均呈现成肌细胞样的细管状形态。3.转染细胞生物学检测(1)免疫荧光检测在转染细胞传代培养后的第17d,将上述3种细胞和作为对照未经转染的骨髓间充质干细胞,用兔MyoD、MyoG、DES抗体处理进行免疫荧光检测。其结果,与对照组不发生绿色荧光相比,三组转染细胞均出现绿色荧光；(2)流式细胞筛选在转染细胞传代培养后的第21d,利用BD Accuri-C6个人型流式细胞仪对3组转染细胞进行流式细胞筛选检测,其结果,三组细胞中三种基因表达(Desmin、MyoD、MyoG)都在96.4%以上(A组,98.6%、99.9%、96.9%；B组,99.9%、98.0%、99.1%;C组,97.4%、96.4%、99.9%)(3) Real-Time PCR检测在转染细胞传代培养后的第28d,对上述三种细胞和作为对照的骨髓间充质干细胞采用实时定量PCR检测(选取三对引物分别为MyoG,Myf5和Desmin,一组内参引物GAPDH)。其结果,与转染前细胞(标准化为1)相比,上述三种处理组的Myf5、MyoG和Desmi的相对表达量与均升高(A组分别为5.126±0.01倍、4.315±0.01倍和3.099+0.01倍；B组分别为4.484±0.01倍、3.124±0.01倍和2.889±0.01倍；C组分别为3.321±0.01倍、2.557±0.01倍和2.712±0.01倍)。上述结果表明,利用小鼠Myf5基因构建的pcDNA3.1-Myf5真核表达载体可以诱导绵羊骨髓间充质干细胞分化为成肌细胞。为BMSCs在组织工程中的进一步应用提供理论依据和技术支持。
【关键词】：Myf5 绵羊 骨髓间充质干细胞 诱导 成肌细胞
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S826;Q813
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 1 绪论10-17
• 1.1 生肌因子5(Myf5)10-12
• 1.1.1 生肌因子5(Myf5)10-11
• 1.1.2 生肌因子5(Myf5)基因的功能11
• 1.1.3 生肌因子5(Myf5)基因调控机制11-12
• 1.2 骨髓间充质于细胞12-15
• 1.2.1 骨髓间充质干细胞的来源12-13
• 1.2.2 骨髓间充质干细胞13-14
• 1.2.3 骨髓间充质干细胞的培养方式14
• 1.2.4 骨髓间充质干细胞的分化及应用14-15
• 1.3 研究目的和意义15-17
• 2 小鼠Myf5基因真核表达载体的构建17-28
• 2.1 实验材料17-19
• 2.1.1 实验动物及菌株17
• 2.1.2 载体信息17
• 2.1.3 主要药品与试剂17-18
• 2.1.4 常用溶液的配置18-19
• 2.1.5 仪器与设备19
• 2.2 实验方法19-25
• 2.2.1 小鼠的Myf5基因的提取、克隆和序列分析19-24
• 2.2.2 小鼠Myf5基因真核表达载体的构建24-25
• 2.3 实验结果25-27
• 2.3.1 小鼠Myf5基因的克隆与序列分析25-26
• 2.3.2 小鼠Myf5基因真核表达载体的构建26-27
• 2.4 讨论27
• 2.5 本章小结27-28
• 3. 转Myf5绵羊骨髓间充质干细胞的分化28-43
• 3.1 实验材料28
• 3.1.1 实验细胞28
• 3.2 实验药品与器材28-29
• 3.2.1 实验药品28
• 3.2.2 实验试剂28-29
• 3.2.3 实验器材29
• 3.3 实验方法29-33
• 3.3.1 骨髓间充质干细胞的培养29
• 3.3.2 Myf5的转染29-30
• 3.3.3 骨髓间充质干细胞的诱导分化30
• 3.3.4 检测30-33
• 3.4 实验结果33-41
• 3.4.1 骨髓间充质干细胞的生长曲线33
• 3.4.2 转染Myf5基因的细胞状态和阳性对照33-35
• 3.4.3 免疫荧光35-38
• 3.4.4 流式细胞分析38-39
• 3.4.5 实时定量PCR39-41
• 3.5 讨论41
• 3.6 本章小结41-43
• 4 结论43-44
• 参考文献44-51
• 附录51-53
• 攻读学位期间发表的学术论文53-54
• 致谢54-55

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本文编号：331896