水稻OsMIR398功能分析
发布时间：2021-08-03 09:23
MicroRNAs（miRNAs）是真核生物中一类长度约为22nt的内源性非编码小分子RNAs,可通过靶向目标mRNAs造成对其切割或阻止其翻译,对植物生长发育、应对生物胁迫和非生物胁迫等方面起着重要的调节作用。已有研究表明miR398在多种植物的胁迫响应中扮演着重要角色。本研究基于CRISPR-Cas9基因组编辑技术,创制了水稻（Oryza sativa L.）OsMIR398定向敲除突变体材料,进行了转录组测序、非生物逆境胁迫分析和农艺性状考察。同时探究了OsMIR398家族成员对靶基因OsCSD2剪切效率。本文主要的研究结果如下:1.对OsMIR398前体时空表达特性分析表明:OsMIR398a在水稻抽穗期的叶片中表达水平最高,OsMIR398b在抽穗期根中表达水平最高,说明OsMIR398家族成员在表达模式上具有明显的差异。2.OsMIR398ab敲除突变体转录组数据显示:突变体miR398ab-1和miR398ab-2表达上调的基因分别有136、176个,下调的基因分别有93、41个,表达水平产生显著差异的基因有24个。经预测发现,OsMIR398a的特异靶基因有86个,Os...
【文章来源】：电子科技大学四川省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
RNA指导下Cas9切割靶DNA的示意图[57]
电子科技大学硕士学位论文20第三章结果与分析3.1OsMIR398前体的时空表达特性分析为了初步了解OsMIR398前体在水稻中的表达情况，本研究对其进行了时空表达特性分析。分别选取日本晴生长三周的水稻幼苗的根、茎、叶和抽穗期间水稻苗的根、茎、叶、叶鞘、穗进行提取RNA、反转录和qPCR实验。其中，OsMIR398a选用引物miRNA398a-F和miRNA398a-R来进行PCR扩增，OsMIR398b选用引物miRNA398b-F和miRNA398b-R进行PCR扩增（引物具体序列见附表1）。结果显示（图3-1）：OsMIR398a在水稻抽穗期的叶片中表达水平最高，根和茎中其表达水平基本相同，在幼苗期的茎中最低，但幼苗的根中OsMIR398a表达水平最高。而OsMIR398b在抽穗期根中表达水平最高，在同时期的茎中表达最低，而在幼苗阶段其在叶片中的表达水平最高。图3-1OsMIR398前体的时空表达特性分析（通过T检验进行显著性差异分析，若p<0.01则为极显著差异（**），0.01<p<0.05则为显著差异（*））3.2OsMIR398敲除突变体筛癣鉴定3.2.1OsMIR398a敲除突变体筛癣鉴定OsMIR398a的CRISPR-Cas9载体（pTL03）由本实验室提供，其载体结构示意图如图3-2a所示。经过水稻遗传转化，得到T0代再生材料。对T0代进行了阳性鉴定，目的片段大小为900bp，结果显示再生植株全部为阳性（图3-2b）。接着通过PCR-SSCP实验对阳性材料进行了基因型鉴定，与野生型相比，其突变类型
第三章结果与分析21多样化（图3-2c）。选取3个代表性植株进行Sanger测序，其中pTL03-03-3植株碱基缺失较多，为-9bp/-21bp（图3-2d）。图3-2OsMIR398a敲除突变体T0代筛癣鉴定图。a.OsMIR398a敲除载体示意图；b.OsMIR398a敲除突变体T0代阳性检测图；c.OsMIR398a敲除突变体T0代SSCP检测图；d.OsMIR398a敲除突变体T0代部分植株测序结果将pTL03-03-3植株经过自交后得到T1代种子，随机选取部分T1代种子进行幼苗培养，以期筛选到无载体的材料。同样，T1代材料也需要通过PCR先进行阳性鉴定实验，目的片段大小为900bp（图3-3a），经检测，pTL03-03-3-1、pTL03-03-3-9、pTL03-03-3-10、pTL03-03-3-15、pTL03-03-3-17植株不含载体。如图3-3b所示，继续对T1代材料进行突变体鉴定，发现这些材料经过基因分离呈现出三种基因类型，即-9bp/-9bp、-9bp/-21bp和-21bp/-21bp。由于在SSCP图中pTL03-03-3-1、pTL03-03-3-9、pTL03-03-3-10、pTL03-03-3-15、pTL03-03-3-17的带型相同，因此选取pTL03-03-3-1进行Sanger测序图（3-3c），pTL03-03-3-1的突变类型与pTL03-03-3相同。最后经过筛癣鉴定获得不含载体的T2代材料，用bcda
【参考文献】：
硕士论文
[1]水稻OsMIR398定向敲除突变体创制及分析[D]. 田莉.电子科技大学 2018
[2]水稻理想株型定向突变体创制及分析[D]. 章登位.电子科技大学 2017
[3]基于毛状根系统的丹参酮代谢调控相关基因功能研究[D]. 孙耿.电子科技大学 2017
本文编号：3319369
【文章来源】：电子科技大学四川省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
RNA指导下Cas9切割靶DNA的示意图[57]
电子科技大学硕士学位论文20第三章结果与分析3.1OsMIR398前体的时空表达特性分析为了初步了解OsMIR398前体在水稻中的表达情况，本研究对其进行了时空表达特性分析。分别选取日本晴生长三周的水稻幼苗的根、茎、叶和抽穗期间水稻苗的根、茎、叶、叶鞘、穗进行提取RNA、反转录和qPCR实验。其中，OsMIR398a选用引物miRNA398a-F和miRNA398a-R来进行PCR扩增，OsMIR398b选用引物miRNA398b-F和miRNA398b-R进行PCR扩增（引物具体序列见附表1）。结果显示（图3-1）：OsMIR398a在水稻抽穗期的叶片中表达水平最高，根和茎中其表达水平基本相同，在幼苗期的茎中最低，但幼苗的根中OsMIR398a表达水平最高。而OsMIR398b在抽穗期根中表达水平最高，在同时期的茎中表达最低，而在幼苗阶段其在叶片中的表达水平最高。图3-1OsMIR398前体的时空表达特性分析（通过T检验进行显著性差异分析，若p<0.01则为极显著差异（**），0.01<p<0.05则为显著差异（*））3.2OsMIR398敲除突变体筛癣鉴定3.2.1OsMIR398a敲除突变体筛癣鉴定OsMIR398a的CRISPR-Cas9载体（pTL03）由本实验室提供，其载体结构示意图如图3-2a所示。经过水稻遗传转化，得到T0代再生材料。对T0代进行了阳性鉴定，目的片段大小为900bp，结果显示再生植株全部为阳性（图3-2b）。接着通过PCR-SSCP实验对阳性材料进行了基因型鉴定，与野生型相比，其突变类型
第三章结果与分析21多样化（图3-2c）。选取3个代表性植株进行Sanger测序，其中pTL03-03-3植株碱基缺失较多，为-9bp/-21bp（图3-2d）。图3-2OsMIR398a敲除突变体T0代筛癣鉴定图。a.OsMIR398a敲除载体示意图；b.OsMIR398a敲除突变体T0代阳性检测图；c.OsMIR398a敲除突变体T0代SSCP检测图；d.OsMIR398a敲除突变体T0代部分植株测序结果将pTL03-03-3植株经过自交后得到T1代种子，随机选取部分T1代种子进行幼苗培养，以期筛选到无载体的材料。同样，T1代材料也需要通过PCR先进行阳性鉴定实验，目的片段大小为900bp（图3-3a），经检测，pTL03-03-3-1、pTL03-03-3-9、pTL03-03-3-10、pTL03-03-3-15、pTL03-03-3-17植株不含载体。如图3-3b所示，继续对T1代材料进行突变体鉴定，发现这些材料经过基因分离呈现出三种基因类型，即-9bp/-9bp、-9bp/-21bp和-21bp/-21bp。由于在SSCP图中pTL03-03-3-1、pTL03-03-3-9、pTL03-03-3-10、pTL03-03-3-15、pTL03-03-3-17的带型相同，因此选取pTL03-03-3-1进行Sanger测序图（3-3c），pTL03-03-3-1的突变类型与pTL03-03-3相同。最后经过筛癣鉴定获得不含载体的T2代材料，用bcda
【参考文献】：
硕士论文
[1]水稻OsMIR398定向敲除突变体创制及分析[D]. 田莉.电子科技大学 2018
[2]水稻理想株型定向突变体创制及分析[D]. 章登位.电子科技大学 2017
[3]基于毛状根系统的丹参酮代谢调控相关基因功能研究[D]. 孙耿.电子科技大学 2017
本文编号：3319369
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/zaizhiyanjiusheng/3319369.html
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