FSTL3基因在绵羊常年发情中的功能研究

发布时间：2017-04-30 15:04

  本文关键词：FSTL3基因在绵羊常年发情中的功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本实验旨在从分子水平和细胞水平上探究FSTL3在绵羊常年发情中的功能,来揭示FSTL3与绵羊繁殖季节性间的关系,为进一步阐明绵羊常年发情的分子机理提供理论基础。通过验证不同生理状态下小尾寒羊和滩羊卵巢中FSTL3基因的表达差异情况,以常年发情的小尾寒羊卵巢颗粒细胞为研究对象,建立稳定的绵羊卵巢颗粒细胞的原代培养体系,在细胞水平上对FSTL3基因进行RNA干扰,利用Real-time PCR、Western-Blot以及免疫荧光技术分别在RNA水平和蛋白水平上验证FSTL3蛋白表达的抑制情况,并通过放射性免疫分析检测FSTL3基因被干扰后颗粒细胞中雌二醇与孕酮浓度的变化,实验结论如下：1.通过RT-PCR检测处于不同生理状态下的小尾寒羊和滩羊卵巢组织中FSTL3基因的表达量,发现在两种绵羊的卵巢组织中,FSTL3基因的表达水平均随着发情周期呈波动性表达：FSTL3基因的表达水平在发情间期达到顶峰,随着发情周期逐渐下降,并在发情期降至最低。在秋季,小尾寒羊和滩羊发情期的FSTL3基因表达量没有差异。在春季时,滩羊处于乏情期,FSTL3基因的表达相对稳定,保持在一个较低的水平；而小尾寒羊FSTL3基因的表达水平依然成周期性变化,为了探究FSTL3基因是否影响小尾寒羊的常年发情启动,我们在细胞水平上进一步研究。2.对原代培养的卵巢颗粒细胞进行FSHR免疫荧光染色,结果显示原代培养的卵巢颗粒细胞纯度高,FSHR阳性率达95%以上,可以直接进行后续实验。3.用RNAi的方法对小尾寒羊卵巢颗粒细胞中FSTL3基因表达进行抑制,通过RT-PCR发现FSTL3基因的3条siRNA的干扰效率分别为62.33%、49.27%、85.84%,其中SiRNA-3能有效地干扰卵巢颗粒细胞中FSTL3基因的表达。4.在蛋白水平上验证RNAi的作用,Western-blot和细胞免疫荧光染色的结果表明,FSTL3干扰组的蛋白表达量极显著降低(P0.01),说明FSTL3蛋白被有效抑制。5.对RNAi后48h的细胞培养基进行放射性免疫分析,结果显示FSTL3基因的表达被抑制后,细胞培养基中的E2含量显著增加(P0.05),P4的含量极显著减少(P0.01),证实FSTL3基因对颗粒细胞分泌E2有一定负调控作用,对P4有正调控作用,进一步表明FSTL3基因可能对绵羊的季节性繁殖有一定调控作用。
【关键词】：FSTL3 小尾寒羊 颗粒细胞 RNAi
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S826
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 1. 文献综述11-20
• 1.1 动物的季节性繁殖11-13
• 1.1.1 季节性繁殖的定义11
• 1.1.2 季节性繁殖的调控机理11-13
• 1.2 颗粒细胞的研究进展13-16
• 1.2.1 颗粒细胞的生物学作用13-15
• 1.2.2 影响颗粒细胞增殖与凋亡的因素15-16
• 1.3 FSTL3的研究进展16-18
• 1.3.1 FSTL3的结构16
• 1.3.2 FSTL3的生物学机制16-18
• 1.4 本实验的研究内容和意义18-20
• 1.4.1 研究内容18
• 1.4.2 研究意义18-20
• 2. 材料和方法20-32
• 2.1 实验材料20
• 2.2 试验时间与地点20
• 2.3 主要试剂20-21
• 2.4 主要仪器设备21-22
• 2.5 试验方法22-32
• 2.5.1 卵巢颗粒细胞原代培养22-23
• 2.5.2 siRNA的设计与合成23
• 2.5.3 RNAi23-24
• 2.5.4 细胞免疫荧光染色24
• 2.5.5 细胞总RNA和蛋白质提取24-26
• 2.5.5.1 RNA提取24-25
• 2.5.5.2 RNA浓度与质量检测25
• 2.5.5.3 蛋白质提取25-26
• 2.5.5.4 蛋白质浓度测定26
• 2.5.6 反转录26-27
• 2.5.7 荧光实时定量检测27-29
• 2.5.7.1 引物设计合成27-28
• 2.5.7.2 标准品的稀释28
• 2.5.7.3 荧光实时定量28-29
• 2.5.8 Western-blot29-31
• 2.5.8.1 SDS-PAGE电泳29-30
• 2.5.8.2 转膜30
• 2.5.8.3 免疫反应30
• 2.5.8.4 化学发光30-31
• 2.5.9 放射免疫分析31-32
• 3. 结果与分析32-47
• 3.1 标准曲线的构建32-35
• 3.2 FSTL3基因表达分析35-36
• 3.3 卵巢颗粒细胞原代培养结果36-38
• 3.3.1 颗粒细胞形态学观察36-37
• 3.3.2 FSHR免疫荧光染色检测37-38
• 3.4 RNAi实验结果38-47
• 3.4.1 RNA浓度与质量检测结果38-40
• 3.4.2 蛋白质浓度与质量检测结果40-41
• 3.4.3 FSTL3基因的siRNA筛选结果41-43
• 3.4.4 FSTL3蛋白表达分析43-45
• 3.4.5 FSTL3对颗粒细胞激素分泌影响的检测45-47
• 4. 讨论47-52
• 4.1 小尾寒羊颗粒细胞原代培养的建立47-48
• 4.2 RNAi抑制FSTL3基因的表达48-50
• 4.3 FSTL3对常年发情的调控作用50
• 4.4 FSTL3对颗粒细胞激素分泌的影响50-52
• 5. 结论52-53
• 6. 参考文献53-61
• 致谢61-62
• 攻读学位期间发表的学术论文62

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