龙眼胚性愈伤组织AGO基因克隆与表达分析

发布时间：2017-05-01 13:14

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【摘要】：龙眼(Dimocarpus longan Lour.),属于无患子科(Sapindaceae)龙眼属(Dimocarpus Lour.)常绿木本植物,龙眼胚胎发育的研究对于龙眼的生产具有重要的意义。植物体胚发育过程是一个复杂的过程,存在着许多代谢途径和基因调控网络,miRNA作为重要的调控因子植物体胚发生过程中一定存在着巨大的作用,与miRNA相互作用的AGO蛋白在龙眼体胚发生过程中也具有重要的作用。本研究拟通过对AGO家族基因进行克隆,以及荧光定量PCR技术对龙眼体胚发生不同阶段以及四季密龙眼不同组织的中AGO基因的表达量进行分析,同时对其亚细胞定位进行研究,为揭示龙眼miRNA调控分子机制提供新的线索,并为调控龙眼等木本植物的胚胎发育提供理论依据。1龙眼胚性愈伤组织AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因cDNA全长克隆通过对龙眼胚性愈伤组织的转录组分析和GeneBank中的比对,龙眼胚性愈伤组织中含有5种AGO蛋白,分别为AGO1、AGO2、AGO4、AGO5、AGO6,其中AG04基因的表达量极低。在此基础上,利用RT-PCR和RACE技术,对AGO1、AGO2、AGO5、AGO6进一步克隆,最终获得它们的cDNA全长序列：AGO1基因cDNA全长为3529 bp,开放阅读框为3183 bp,编码1061个氨基酸,命名为DlAGO1, GeneBank登录号为KM001869; AGO2基因全长为3128 bp,5端UTR长度为73 bp,3端UTR长度为121 bp,开放阅读框为2934bp(含终止子),编码976个氨基酸,命名为DlAG02,登录号为KM001870; AGO5基因的全长为3203 bp,开放阅读框为2919 bp,编码972个氨基酸,命名为DlAG05,登录号为KM001871；龙眼胚性愈伤组织AG06基因cDNA的全长序列3168 bp,开放阅读框(ORF)长为2700 bp,编码900个氨基酸,命名为DlAGO6,登录号为KF819529。2龙眼胚性愈伤组织AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因的生物信息学分析在上述基础上,利用生物信息学对龙眼胚性愈伤组织AGO基因家族的基因进行基本理化性质、磷酸化位点、蛋白质保守结构域等进行分析。对龙眼胚性愈伤组织中AGO1、AGO2、AGO5和AG06基因编码的氨基酸保守结构域分析结果显示,DLAGO2 PIWI区域含有DDD结构,DlAGO2、DlAGO5和DlAGO6含有DDH结构,由此推测龙眼胚性愈伤组织的AGO1、AGO2、AGO5、AGO6蛋白可能具有切割mRNA功能,参与转录后水平基因沉默。磷酸化位点的预测结果显示,DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5和DlAGO6蛋白丝氨酸磷酸化位点较多并N、C两端分布密集,中间部分分布均匀,AGO蛋白的PIWI结构域具有RNA内切酶活性,而该蛋白丰富的丝氨酸磷酸化位点,可能为增加该蛋白与小RNA结合后的转录后表达调控作用。DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5和DlAGO6与拟南芥、水稻、葡萄AGO蛋白家族系统进化树分析,发现龙眼胚性愈伤组织的AGO蛋白可能分为四个分支,并且DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5和DlAGO6分别属于龙眼胚性愈伤组织AGO蛋白的四个分支。3龙眼体胚发生过程以及龙眼不同组织器官中AGO1、AGO2、 AGO5和AGO6基因家族的表达定量分析用实时荧光定量技术对AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因在龙眼体胚发生过程中以及不同组织器官中进行相对定量表达分析。龙眼不同胚性阶段的表达情况：在龙眼体胚发生过程早期,随着体胚发生过程的推进,AGO1基因的表达量逐渐升高,在子叶时期的表达量有所降低,整体来看在非胚性阶段的时候表达量是最高的；AGO2基因在龙眼的不同胚性阶段的表达量具有差异,从整体趋势来说,相对表达量的趋势呈M型,在愈伤组织和球形胚时期的表达量是M型的两个顶点,在非胚性阶段、不完全紧实结构以及子叶胚时期表达量相对较低；AGO5基因在龙眼体胚的不同阶段的表达具有显著的差异,整体的呈现逐渐降低的趋势,随着体胚发生过程的推进,AGO5基因的表达逐渐降低,非胚性阶段的表达量高于其它胚性阶段；AGO6基因在龙眼体胚的不同阶段的表达具有显著的差异,整体的呈现逐渐降低的趋势,随着体胚发生过程的推进,AGO6基因的表达逐渐降低,但非胚性愈伤组织中的表达量相对低很多。龙眼不同组织部位的表达情况：AGO基因在龙眼不同组织部位中的表达具有差异显著,其中AGO1基因在叶、花蕾、小果、大果、果皮以及种子中的表达量相对较低,在果肉中的相对表达量最高,可能与果肉的形成有关,另外在成花和根中的相对表达量同样较高的,因此AGO1基因可能与花和根的发育相关miRNA具有相互作用关系；AGO2基因在根、叶、花蕾、成花、小果、大果、果肉、种子的表达量相对较低,在果皮内的含量很高,推测AGO2基因与果皮的发育有关的miRNA具有相互作用。AGO5基因果皮中的表达量显著高于其他组织部位,这个与AGO2基因相似,可能与AGO2基因有相互作用关系；AGO5基因在小果中的表达量极低,在大果中表达量也不高,却在果皮中表达量高,推测可能在果实成熟后期的果皮发育过程中具有重要作用；AGO6基因成花与果肉的表达最高,在叶、大果、果皮的表达量相对较低,在根和花蕾相对表达量较高,小果和种子的相对表达量高于叶等的组织部位。4龙眼胚性愈伤组织AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因的亚细胞定位分析本研究过程中构建了龙眼胚性愈伤组织AGO1、AGO2、AGO5和AGO6蛋白的亚细胞定位载体,采用了农杆菌瞬时表达技术,于洋葱表皮细胞中观察AGO1、AGO2、AGO5和AGO6亚细胞定位荧光信号,结果显示,AGO1主要在细胞核和微体中,AGO2主要集中于细胞核和细胞质中,AGO5和AGO6主要集中于细胞核和细胞膜上。龙眼胚性愈伤组织AGO蛋白都定位于细胞核中,细胞核是生物体遗传物质以及核糖体合成的主要场所,对于细胞周期以及细胞衰老都具有重要功能,AGO蛋白的亚细胞定位的研究,有助于进一步探究基因功能。综上所述,通过龙眼胚性愈伤组织AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因的序列和生物信息学分析,可以发现龙眼胚性愈伤组织AGO基因家族序列保守性较强,是一类保守的碱性蛋白,且龙眼AGO蛋白可以分为与水稻类似的四个分支。AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因在龙眼体胚发生过程中的差异表达,推测可能与细胞分裂速率有关,并在四季蜜不同组织中的差异表达,推测其可能参与特定器官的形态建成。亚细胞定位显示AGO1、AGO2、AGO5和AGO6均定位于细胞核中。细胞核是生物体遗传物质以及核糖体合成的主要场所,对于细胞周期以及细胞衰老都具有重要功能,AGO蛋白的克隆、生物信息学分析、表达分析及亚细胞定位的研究,有助于进一步探究该基因的功能。
【关键词】：龙眼 体胚发生 AGO 基因克隆 定量PCR 亚细胞定位
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S667.2
【目录】：

• 缩写词9-10
• 摘要10-13
• Abstract13-17
• 第一章 引言17-27
• 1 植物体胚发生研究进展18-19
• 2 植物miRNA研究进展19-21
• 2.1 植物miRNA起源19-20
• 2.2 植物miRNA生物合成过程20
• 2.3 植物miRNA的调控作用机制20-21
• 2.4 植物miRNA的鉴定21
• 3 植物AGO蛋白的研究进展21-24
• 3.1 AGO蛋白的分类22
• 3.2 AGO蛋白的功能22-23
• 3.3 AGO蛋白的功能结构域23-24
• 3.4 AGO蛋白与miRNA结合的影响因素24
• 4 龙眼体胚发生的分子生物学研究进展24-25
• 5 本研究的意义及主要研究内容25-27
• 5.1 本研究的意义25-26
• 5.2 本研究的主要内容26-27
• 第二章 龙眼胚性愈伤组织AGO家族基因cDNA全长克隆27-49
• 1 材料与方法28-30
• 1.1 供试材料28
• 1.2 方法28-30
• 1.2.1 总RNA提取及cDNA的合成28
• 1.2.2 龙眼胚性愈伤组织AGO基因转录组分析28
• 1.2.3 引物设计28
• 1.2.4 目的片段扩增28-30
• 1.2.5 目的片段回收、TA克隆和测序30
• 1.2.6 序列拼接30
• 2 结果与分析30-47
• 2.1 龙眼胚性愈伤组织基因转录组数据分析30
• 2.2 龙眼胚性愈伤组织jca?基因cDNA全长序列的克隆30-35
• 2.3 龙眼胚性愈伤组织AGO2基因cDNA全长序列的克隆35-39
• 2.4 龙眼胚性愈伤组织AGO5基因cDNA全长序列的克隆39-43
• 2.5 龙眼胚性愈伤组织AGO6基因cDNA全长序列的克隆43-47
• 3 讨论47-49
• 3.1 龙眼胚性愈伤组织AGO基因是保守性蛋白47
• 3.2 龙眼胚性愈伤组织AGO1、AGO2、AGO5、AGO6基因克隆意义47-49
• 第三章 龙眼胚性愈伤组织AGO家族基因的生物信息学分析49-72
• 1 材料和方法49
• 1.1 材料49
• 1.2 方法49
• 2 结果与分析49-70
• 2.1 蛋白质的理化性质分析49-51
• 2.2 蛋白的信号肽及亚细胞定位预测51-53
• 2.3 蛋白质跨膜结构预测53-55
• 2.4 蛋白质磷酸化结构预测55-58
• 2.5 蛋白卷曲螺旋结构预测58-59
• 2.6 蛋白质结构特征分析59
• 2.7 蛋白质二级结构分析59-66
• 2.8 蛋白质的三级结构分析66-68
• 2.9 龙眼胚性愈伤组织AGO蛋白中AGO1、AGO2、AGO5以及AGO6的系统进化树的构建68-70
• 3 讨论70-72
• 3.1 龙眼胚性愈伤组织DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5、DlAGO6蛋白能具有切割mRNA功能,参与转录后水平基因沉默70-71
• 3.2 龙眼胚性愈伤组织DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5、DlAGO6丝氨酸磷酸化位点含量丰富,推测转录调控表达作用相关71
• 3.3 龙眼胚性愈伤组织DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5、DlAGO6进化树分析,推测龙眼胚性愈伤组织AGO蛋白分为四个分支71-72
• 第四章 龙眼体胚发生过程以及龙眼不同组织器官中AGO基因家族的表达定量分析72-82
• 1 材料与试剂72-74
• 1.1 材料72
• 1.2 主要试剂和仪器72
• 1.3 方法72-74
• 1.3.1 龙眼体胚发生不同阶段材料总RNA提取及cDNA合成72-73
• 1.3.2 引物设计73
• 1.3.3 实时荧光定量PCR73-74
• 1.3.4 标准曲线的制定74
• 2 结果与分析74-79
• 2.1 龙眼AGO1基因的差异表达分析74-76
• 2.1.1 龙眼体胚发生过程中AGO1基因的差异表达74-75
• 2.1.2 龙眼不同组织部位AGO1基因的差异表达75-76
• 2.2 龙眼AGO2基因的差异表达分析76-77
• 2.2.1 龙眼体胚发生过程中AGO2基因的差异表达76
• 2.2.2 龙眼不同组织部位AGO2基因的差异表达76-77
• 2.3 龙眼AGO5基因的差异表达分析77-78
• 2.3.1 龙眼体胚发生过程中AGO5基因的差异表达77-78
• 2.3.2 龙眼不同组织部位AGO5基因的差异表达78
• 2.4 龙眼AGO6基因的差异表达分析78-79
• 2.4.1 龙眼体胚发生过程中AGO6基因的差异表达78-79
• 2.4.2 龙眼不同组织部位AGO6基因的差异表达79
• 3 讨论79-82
• 3.1 龙眼胚性愈伤组织AGO1、AGO2、AGO5、AGO6在龙眼体胚发生过程中的差异表达,推测可能与细胞分裂速率有关79-80
• 3.2 AGO1、AGO2、AGO5、AGO6在四季蜜不同组织中的差异表达,可能参与特定器官的形态建成80-82
• 第五章 龙眼AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因的亚细胞定位分析82-89
• 1 材料与试剂82
• 1.1 菌株与载体82
• 1.2 受体材料82
• 1.3 生化试剂82
• 1.4 仪器设备82
• 2 实验方法82-85
• 2.1 总RNA的提取以及cDNA的合成82-83
• 2.2 基因序列分析83
• 2.3 引物的设计与合成83
• 2.4 候选基因的PCR扩增83-84
• 2.5 载体酶切84
• 2.6 重组质粒并鉴定84
• 2.7 重组质粒转化农杆菌84-85
• 2.8 瞬时表达载体转化洋葱表皮以及显微观察85
• 3 结果与分析85-88
• 3.1 AGO蛋白信号肽序列分析以及核定位信号分析85-86
• 3.2 龙眼AGO1、AGO2、AGO5、AGO6基因亚细胞定位载体的构建86-87
• 3.3 龙眼愈伤组织cDNAAGO1、AGO2、AGO5、AGO6基因的亚细胞定位共聚焦观察分析87-88
• 4 讨论88-89
• 第六章 小结89-92
• 1 龙眼胚性愈伤组织AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因cDNA全长克隆89-90
• 2 龙眼胚性愈伤组织AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因的生物信息学分析90
• 3 龙眼体胚发生过程以及龙眼不同组织器官中AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因家族的表达定量分析90-91
• 4 龙眼胚性愈伤组织AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因家族的亚细胞定位分析91-92
• 参考文献92-100
• 附录 GenBank上登录的龙眼愈伤组字AGO基因家族的序列信息100-112
• 攻读硕士期间发表论文、参加学术会议与获奖情况112-113
• 致谢113

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1 杨曼曼;龙眼胚性愈伤组织AGO基因克隆与表达分析[D];福建农林大学;2015年

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本文编号：338995