双峰驼FCGRT和PIGR基因的原核表达及抗体制备
发布时间：2021-10-22 04:12
在哺乳动物体内,免疫球蛋白受体在免疫防御中起着重要作用,而负责运输免疫球蛋白G（IgG）的新生儿Fc受体（FcRn）（α链）及负责运输免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白M（IgM）的聚合免疫球蛋白受体（pIgR）分别由FCGRT和PIGR基因编码。为了制备抗双峰驼FcRn和pIgR的多克隆抗体,为本实验室后期进一步研究双峰驼免疫球蛋白受体在其不同黏膜表面的分布规律和黏膜免疫反应之间的关系提供依据。本研究由以下两方面构成:（1）首先分别从NCBI收录的双峰驼FCGRT和PIGR基因序列中选取编码区,经跨膜结构和信号肽预测分析,截取不含信号肽的膜外序列,经酶切位点预测后构建重组质粒pET-28a-FcRn和pET-28a-pIgR;然后,将其分别转入感受态细胞BL21（DE3）和Rosetta（DE3）中,经1.0 mmol·L-1 IPTG诱导表达6 h后进行SDS-PAGE检测。接着,分别以0.1 mmol·L-1、0.3 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、0.7 mmol·L-...
【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
IgG和白蛋白的FcRn挽救途径（引自BaldwinWM，2019）
甘肃农业大学2020届硕士学位论文8基因的多态性与免疫球蛋白A肾病相关[81]，进一步强调了pIgR的临床重要性。图2聚合免疫球蛋白受体（pIgR）通过极化上皮细胞的途径（引自KaetzelCS，2005）Fig.2ThepathwayofpIgRthroughpolarizedepithelialcells(fromkaetzelCS,2005)3.3.2pIgR的免疫功能通过pIgR产生的SC除了促进pIg的运输外，对SIg也至关重要[62]。首先，SC增强了SIg的稳定性。虽然SC不改变SIg抗原的亲和力[82]，但SC被认为有助于SIg抵抗肠道内宿主和细菌酶的蛋白水解[83]。然而，已有病原体进化出了克服增强的蛋白质水解抗性的方法，尤其是链球菌特异性蛋白酶对pIg和SIg的降解作用相似[84]。第二，SC帮助在黏液层中适当地定位SIg。SC和pIg均通过N-键和o-键发生糖基化[85]，这些糖基化作用有助于上皮细胞的胞吞作用和SIg的释放[86]。在远端胃肠道中，SIg通过厚的内黏液层扩散并附着于外黏液层，肠道细菌通过与这些碳水化合物结合而定位于外黏液层[80]。第三，SC是非特异性的微生物清道夫。N-和o-链糖基化都介导细菌的附着，帮助细菌在黏液层的隔离[87]。例如，SC通过与非特异性的糖链相互作用，凝集和中和艰难梭菌毒素A[88]。此外，肠致病性大肠杆菌内毒素蛋白和1型脊椎凝集素的聚糖结合能力介导了SIgA结合，从而在体外凝集细菌并防止上皮细胞损伤[77]。天然的、非特异性的SIgA还能在体内降低霍乱弧菌的细菌载量，并在体外依赖SC上存在的含甘露糖的寡糖抑制生物膜的形成[89]。天然SIgA进一步介导体内凝集和管腔内免疫排斥，清除肠球菌[90]和肠伤寒沙门氏菌，从而减少两种病原体的感染和炎症[91]。因
甘肃农业大学2020届硕士学位论文202试验结果2.1双峰驼FCGRT基因合成与重组质粒构建的结果通过对双峰驼FcRn蛋白亲水性（见图1-1A）和抗原表位（见图1-1B）的预测分析，表明该蛋白为抗原指数较高的疏水性蛋白；跨膜结构预测FcRn蛋白总共有355个氨基酸，其中氨基酸1-299为膜外区（见图1-2），利用Editseq（DNASTAR7.0）截取膜外部分；信号肽预测该蛋白氨基酸1-24为信号肽部分（见图1-3），截除信号肽，剩余275个氨基酸，然后在上游和下游分别添加起始密码子ATG和终止密码子TAG，最终预测该FcRn重组蛋白大小为34KDa。图1-1双峰驼FcRn蛋白亲水性与抗原表位的预测Fig.1-1PredictionofthehydropHilicityandepitopeofFcRnproteininBactriancamel图1-2双峰驼FcRn蛋白跨膜区的预测Fig.1-2PredictionofFcRnproteintransmembraneregioninBactriancamel
【参考文献】：
期刊论文
[1]双峰驼血清IgG亚型的分离纯化及多克隆抗体的制备[J]. 李东海,张旺东,程翠翠,贾帅,李建飞,令小东,何晚红,高欣,刘磊,王雯慧. 兽类学报. 2018(05)
[2]Expression of pIgR in the tracheal mucosa of SHIV/SIV-infected rhesus macaques[J]. Dong Li,Feng-Jie Wang,Lei Yu,Wen-Rong Yao,Yan-Fang Cui,Gui-Bo Yang. Zoological Research. 2017(01)
[3]用CODEHOP法设计简并引物克隆草鱼多聚免疫球蛋白受体基因片段[J]. 许国晶,王超,孟庆磊,刘峰,刘飞,陈秀丽. 大连海洋大学学报. 2015(02)
[4]IPTG诱导浓度、时间及温度对重组鲑鱼降钙素与降钙素基因相关肽融合基因表达的影响[J]. 余琼,赵丽华,李洪丽,张巍,梁利恒. 黑龙江大学自然科学学报. 2012(02)
[5]猪α干扰素基因经密码子改造在毕赤酵母菌中的高效分泌表达[J]. 刘健,陈瑞爱,刘珊珊,朱杰仪,唐明森,罗满林. 华南农业大学学报. 2011(01)
[6]不同破壁方法对大肠杆菌DNA提取的影响[J]. 丁小云,耿俊丽,魏成熙. 贵州农业科学. 2010(04)
[7]鸡IL-2全基因和去信号肽基因的原核表达[J]. 龚婷,杨孝朴,李银聚,张春杰,吴庭才,程相朝. 甘肃农业大学学报. 2009(01)
博士论文
[1]双峰驼PIGR和FCGRT的基因克隆、生物信息学分析及在扁桃体中表达特性的研究[D]. 贾帅.甘肃农业大学 2017
硕士论文
[1]超声波辅助珠磨法破壁微拟球藻细胞[D]. 刘习军.华南理工大学 2019
[2]重组大肠杆菌表达包涵体药物蛋白的复性与纯化研究[D]. 何伟.华东理工大学 2017
[3]双峰驼黏膜免疫效应分子sIgA分泌细胞在小肠分布规律的研究[D]. 张林江.甘肃农业大学 2012
[4]双峰驼IgGs的提取、抗体制备及其分泌细胞在小肠分布规律的研究[D]. 张旺东.甘肃农业大学 2012
本文编号：3450358
【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
IgG和白蛋白的FcRn挽救途径（引自BaldwinWM，2019）
甘肃农业大学2020届硕士学位论文8基因的多态性与免疫球蛋白A肾病相关[81]，进一步强调了pIgR的临床重要性。图2聚合免疫球蛋白受体（pIgR）通过极化上皮细胞的途径（引自KaetzelCS，2005）Fig.2ThepathwayofpIgRthroughpolarizedepithelialcells(fromkaetzelCS,2005)3.3.2pIgR的免疫功能通过pIgR产生的SC除了促进pIg的运输外，对SIg也至关重要[62]。首先，SC增强了SIg的稳定性。虽然SC不改变SIg抗原的亲和力[82]，但SC被认为有助于SIg抵抗肠道内宿主和细菌酶的蛋白水解[83]。然而，已有病原体进化出了克服增强的蛋白质水解抗性的方法，尤其是链球菌特异性蛋白酶对pIg和SIg的降解作用相似[84]。第二，SC帮助在黏液层中适当地定位SIg。SC和pIg均通过N-键和o-键发生糖基化[85]，这些糖基化作用有助于上皮细胞的胞吞作用和SIg的释放[86]。在远端胃肠道中，SIg通过厚的内黏液层扩散并附着于外黏液层，肠道细菌通过与这些碳水化合物结合而定位于外黏液层[80]。第三，SC是非特异性的微生物清道夫。N-和o-链糖基化都介导细菌的附着，帮助细菌在黏液层的隔离[87]。例如，SC通过与非特异性的糖链相互作用，凝集和中和艰难梭菌毒素A[88]。此外，肠致病性大肠杆菌内毒素蛋白和1型脊椎凝集素的聚糖结合能力介导了SIgA结合，从而在体外凝集细菌并防止上皮细胞损伤[77]。天然的、非特异性的SIgA还能在体内降低霍乱弧菌的细菌载量，并在体外依赖SC上存在的含甘露糖的寡糖抑制生物膜的形成[89]。天然SIgA进一步介导体内凝集和管腔内免疫排斥，清除肠球菌[90]和肠伤寒沙门氏菌，从而减少两种病原体的感染和炎症[91]。因
甘肃农业大学2020届硕士学位论文202试验结果2.1双峰驼FCGRT基因合成与重组质粒构建的结果通过对双峰驼FcRn蛋白亲水性（见图1-1A）和抗原表位（见图1-1B）的预测分析，表明该蛋白为抗原指数较高的疏水性蛋白；跨膜结构预测FcRn蛋白总共有355个氨基酸，其中氨基酸1-299为膜外区（见图1-2），利用Editseq（DNASTAR7.0）截取膜外部分；信号肽预测该蛋白氨基酸1-24为信号肽部分（见图1-3），截除信号肽，剩余275个氨基酸，然后在上游和下游分别添加起始密码子ATG和终止密码子TAG，最终预测该FcRn重组蛋白大小为34KDa。图1-1双峰驼FcRn蛋白亲水性与抗原表位的预测Fig.1-1PredictionofthehydropHilicityandepitopeofFcRnproteininBactriancamel图1-2双峰驼FcRn蛋白跨膜区的预测Fig.1-2PredictionofFcRnproteintransmembraneregioninBactriancamel
【参考文献】：
期刊论文
[1]双峰驼血清IgG亚型的分离纯化及多克隆抗体的制备[J]. 李东海,张旺东,程翠翠,贾帅,李建飞,令小东,何晚红,高欣,刘磊,王雯慧. 兽类学报. 2018(05)
[2]Expression of pIgR in the tracheal mucosa of SHIV/SIV-infected rhesus macaques[J]. Dong Li,Feng-Jie Wang,Lei Yu,Wen-Rong Yao,Yan-Fang Cui,Gui-Bo Yang. Zoological Research. 2017(01)
[3]用CODEHOP法设计简并引物克隆草鱼多聚免疫球蛋白受体基因片段[J]. 许国晶,王超,孟庆磊,刘峰,刘飞,陈秀丽. 大连海洋大学学报. 2015(02)
[4]IPTG诱导浓度、时间及温度对重组鲑鱼降钙素与降钙素基因相关肽融合基因表达的影响[J]. 余琼,赵丽华,李洪丽,张巍,梁利恒. 黑龙江大学自然科学学报. 2012(02)
[5]猪α干扰素基因经密码子改造在毕赤酵母菌中的高效分泌表达[J]. 刘健,陈瑞爱,刘珊珊,朱杰仪,唐明森,罗满林. 华南农业大学学报. 2011(01)
[6]不同破壁方法对大肠杆菌DNA提取的影响[J]. 丁小云,耿俊丽,魏成熙. 贵州农业科学. 2010(04)
[7]鸡IL-2全基因和去信号肽基因的原核表达[J]. 龚婷,杨孝朴,李银聚,张春杰,吴庭才,程相朝. 甘肃农业大学学报. 2009(01)
博士论文
[1]双峰驼PIGR和FCGRT的基因克隆、生物信息学分析及在扁桃体中表达特性的研究[D]. 贾帅.甘肃农业大学 2017
硕士论文
[1]超声波辅助珠磨法破壁微拟球藻细胞[D]. 刘习军.华南理工大学 2019
[2]重组大肠杆菌表达包涵体药物蛋白的复性与纯化研究[D]. 何伟.华东理工大学 2017
[3]双峰驼黏膜免疫效应分子sIgA分泌细胞在小肠分布规律的研究[D]. 张林江.甘肃农业大学 2012
[4]双峰驼IgGs的提取、抗体制备及其分泌细胞在小肠分布规律的研究[D]. 张旺东.甘肃农业大学 2012
本文编号：3450358
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