玉米弯孢叶斑病菌非核糖体肽合成酶4（ClNPS4）基因功能初步研究
发布时间：2021-10-24 10:06
由新月弯孢菌[Curvularia lunata（Wakker）Boed.]侵染引起的玉米弯孢叶斑病是全世界分布最广泛的玉米叶部病害之一,也给我国玉米产业造成严重威胁。目前对于玉米弯孢叶斑病菌致病因子的研究主要集中在细胞壁降解酶、非寄主选择性毒素、黑色素及营养元素铁离子等方面,对其次生代谢途径及其产物对致病力影响分子机制的研究工作较少。微生物的非核糖体肽合成酶（Nonribosomal Peptide Synthetase）负责合成低分子量次生代谢产物。其中NPS6和NPS2在多个丝状真菌中结构保守,功能稳定,分别与胞外铁载体生物合成和胞内铁载体生物合成密切相关;NPS4在病原菌表面疏水性和分生孢子形态建成等方面起到重要作用。目前,该基因对玉米弯孢叶斑病菌生长发育和致病机理影响尚不明确,因此本文通过NCBI的blast获得ClNPS4及其他子囊菌属真菌NPS4序列,建立系统发育树并预测其蛋白结构域,构建了NPS4基因敲除载体和互补载体,采用ATMT（Agrobacterium tumeficans-mediated transformation）遗传转化的方法获得其敲除与互补突变体,最...
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：92 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
非核糖体肽合成酶基本结构域及其功能Fig1-1.ThebasicdomainsandfunctionsofNon-ribosomalpeptidesynthetase
沈阳农业大学硕士学位论文第17页共80页2.2.4结构域预测将ClNPS4蛋白序列输入nrps-pksframe中，进行结构域预测。结果表明ClNPS4结构域由19个模块构成，分别由C、A、T、E这四个结构域组成，与ChNPS4结构域模块完全一致（图2-3），我们由此推测ClNPS4的功能可能与ChNPS4功能相似。图2-3ClNPS4结构域预测Fig.2-3DomainanalysisofClNPS4A结构域:腺苷结构域,T结构域:巯基化结构域,C结构域:缩合结构域,E结构域:异构化酶功能域.Adomain:Adenylationdomain,Tdomain:Thiolationdomain,Cdomain:Condensationdomain,Edomain:Epimerasedomain.2.2.5次生代谢产物预测将ClNPS4基因序列输入anti-SMASH中，进行次生代谢产物预测。结果表明预测到的ClNPS4次生代谢产物化学式为C10N4O4H17，结构如下（图2-4）。图2-4ClNPS4次生代谢产物结构Fig.2-4SecondarymetabolitestructureofClNPS42.2.6蛋白理化性质分析通过ClNPS4的理化性质分析发现，ClNPS4分子量为796174.51kD，理论等电点为5.69，在所有的氨基酸残基中，亮氨酸（Leu）比重最大，占整个编码蛋白的9.8%。正电荷残基数(Arg+Lys):819，负电荷残基数(Asp+Glu):675。ClNPS4的原子组成为C35350H55750N9732O10718S237，消光系数在280nm时为111787。不稳定系数为40.07，表明ChNPS4ClNPS4FgNPS4
第二章玉米弯孢叶斑病菌NPS4基因克隆及生物信息学分析第18页共80页该蛋白是一个不稳定蛋白，在动物体内半衰期为30h，在酵母体内>20h,大肠杆菌体内>10h。ClNPS4的脂肪系数为90.42。2.2.7蛋白亲疏水性分析通过ClNPS4的亲疏水性分析发现，ClNPS4的亲水性最大值为3.100，总平均亲水性为-0.178，表明其无亲水性偏好（图2-5）。图2-5ClNPS4疏水性/亲水性预测Fig.2-5DistributingcurveofhydropathyoftheClNPS4aminoacid2.2.8蛋白跨膜结构域分析通过分析ClNPS4跨膜结构域发现，ClNPS4不存在跨膜区（图2-6）。图2-6ClNPS4蛋白跨膜结构域分析Fig.2-6TransmembranceregionanalysisofClNPS42.2.9蛋白二级结构预测ClNPS4二级结构预测结果表明，存在四种二级结构，其中α-螺旋（Alphahelix）占42.19%，延伸链（Extendedstrand）占18.10%，β-转角（Betaturn）占8.24%，无规则卷曲（Randomcoil）占31.48%（图2-7），二级结构中α-螺旋占比例最大。
【参考文献】：
期刊论文
[1]黑曲霉中生物合成赭曲霉毒素A的非核糖体肽合成酶基因的鉴定[J]. 陈美榕,张梦薇,刘舒雯,朱柳杨,张健. 菌物学报. 2020(03)
[2]内生真菌HND5菌株抗香蕉枯萎病菌相关非核糖体多肽合成酶基因簇的鉴定[J]. 杨扬,陈奕鹏,周维,蔡吉苗,王宝,黄贵修. 植物保护学报. 2019(05)
[3]玉米弯孢叶斑病菌PG基因家族鉴定与表达分析[J]. 刘震,赵丰舟,崔佳,曲建楠,刘铜,左豫虎. 玉米科学. 2018(04)
[4]一种快速高效构建植物表达载体的方法[J]. 韩凯,翁建峰,郝转芳,李新海,李明顺,张德贵,白丽,张世煌,薛吉全,谢传晓. 玉米科学. 2012(01)
[5]玉米弯孢病菌毒素的研究进展[J]. 张欣芳,苏前富,宋淑云,张伟,李红,刘影,晋齐鸣. 玉米科学. 2009(06)
[6]寄主抗性胁迫下玉米弯孢叶斑病菌致病力相关蛋白与基因表达的分析[J]. 周斐红,刘力行,陈捷,姜雪,刘铜,黄秀丽,翟羽红. 自然科学进展. 2009(09)
[7]几种植物转基因表达载体的构建方法[J]. 林春晶,韦正乙,蔡勤安,侯敬尧,邢少辰. 生物技术. 2008(05)
[8]不同抗性玉米自交系对玉米弯孢菌侵染应答反应差异蛋白分析[J]. 黄秀丽,刘力行,翟羽红,刘铜,陈捷. 自然科学进展. 2008(10)
[9]非核糖体肽合成酶（NRPSs）作用机理与应用的研究进展[J]. 王世媛. 微生物学报. 2007(04)
[10]玉米弯孢菌黑色素性质及其在致病性中的作用研究[J]. 王晓飞,薛春生,徐书法,刘力行,陈捷. 安徽农业科学. 2007(21)
博士论文
[1]铁离子通道关键酶基因ClNPS6和ClFtr1调控玉米弯孢叶斑病菌致病力的分子机制[D]. 路媛媛.沈阳农业大学 2018
[2]clvelB和clt-1基因调控玉米弯孢叶斑病菌毒素合成的分子基础研究[D]. 高金欣.上海交通大学 2017
[3]辣椒疫霉（Phytophthora capsici）5个果胶甲基酯酶基因克隆及pcpme1的功能研究[D]. 贾永健.山东农业大学 2008
硕士论文
[1]苹果树腐烂病菌NRPS基因VmG10的功能研究[D]. 孙红云.西北农林科技大学 2019
[2]NRPS-A在侧孢短芽孢杆菌S62-9抗菌肽生物合成中的功能分析[D]. 刘洋.河北农业大学 2018
[3]稻曲病菌NRPS2与NRPS6基因的功能研究[D]. 韩雨.西北农林科技大学 2018
[4]吡啶霉素中NRPS模块PyrG的功能研究[D]. 李丽丽.上海交通大学 2012
[5]玉米弯孢霉叶斑病菌Clm1基因的克隆与功能分析[D]. 王嘉渊.上海交通大学 2011
本文编号：3455088
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：92 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
非核糖体肽合成酶基本结构域及其功能Fig1-1.ThebasicdomainsandfunctionsofNon-ribosomalpeptidesynthetase
沈阳农业大学硕士学位论文第17页共80页2.2.4结构域预测将ClNPS4蛋白序列输入nrps-pksframe中，进行结构域预测。结果表明ClNPS4结构域由19个模块构成，分别由C、A、T、E这四个结构域组成，与ChNPS4结构域模块完全一致（图2-3），我们由此推测ClNPS4的功能可能与ChNPS4功能相似。图2-3ClNPS4结构域预测Fig.2-3DomainanalysisofClNPS4A结构域:腺苷结构域,T结构域:巯基化结构域,C结构域:缩合结构域,E结构域:异构化酶功能域.Adomain:Adenylationdomain,Tdomain:Thiolationdomain,Cdomain:Condensationdomain,Edomain:Epimerasedomain.2.2.5次生代谢产物预测将ClNPS4基因序列输入anti-SMASH中，进行次生代谢产物预测。结果表明预测到的ClNPS4次生代谢产物化学式为C10N4O4H17，结构如下（图2-4）。图2-4ClNPS4次生代谢产物结构Fig.2-4SecondarymetabolitestructureofClNPS42.2.6蛋白理化性质分析通过ClNPS4的理化性质分析发现，ClNPS4分子量为796174.51kD，理论等电点为5.69，在所有的氨基酸残基中，亮氨酸（Leu）比重最大，占整个编码蛋白的9.8%。正电荷残基数(Arg+Lys):819，负电荷残基数(Asp+Glu):675。ClNPS4的原子组成为C35350H55750N9732O10718S237，消光系数在280nm时为111787。不稳定系数为40.07，表明ChNPS4ClNPS4FgNPS4
第二章玉米弯孢叶斑病菌NPS4基因克隆及生物信息学分析第18页共80页该蛋白是一个不稳定蛋白，在动物体内半衰期为30h，在酵母体内>20h,大肠杆菌体内>10h。ClNPS4的脂肪系数为90.42。2.2.7蛋白亲疏水性分析通过ClNPS4的亲疏水性分析发现，ClNPS4的亲水性最大值为3.100，总平均亲水性为-0.178，表明其无亲水性偏好（图2-5）。图2-5ClNPS4疏水性/亲水性预测Fig.2-5DistributingcurveofhydropathyoftheClNPS4aminoacid2.2.8蛋白跨膜结构域分析通过分析ClNPS4跨膜结构域发现，ClNPS4不存在跨膜区（图2-6）。图2-6ClNPS4蛋白跨膜结构域分析Fig.2-6TransmembranceregionanalysisofClNPS42.2.9蛋白二级结构预测ClNPS4二级结构预测结果表明，存在四种二级结构，其中α-螺旋（Alphahelix）占42.19%，延伸链（Extendedstrand）占18.10%，β-转角（Betaturn）占8.24%，无规则卷曲（Randomcoil）占31.48%（图2-7），二级结构中α-螺旋占比例最大。
【参考文献】：
期刊论文
[1]黑曲霉中生物合成赭曲霉毒素A的非核糖体肽合成酶基因的鉴定[J]. 陈美榕,张梦薇,刘舒雯,朱柳杨,张健. 菌物学报. 2020(03)
[2]内生真菌HND5菌株抗香蕉枯萎病菌相关非核糖体多肽合成酶基因簇的鉴定[J]. 杨扬,陈奕鹏,周维,蔡吉苗,王宝,黄贵修. 植物保护学报. 2019(05)
[3]玉米弯孢叶斑病菌PG基因家族鉴定与表达分析[J]. 刘震,赵丰舟,崔佳,曲建楠,刘铜,左豫虎. 玉米科学. 2018(04)
[4]一种快速高效构建植物表达载体的方法[J]. 韩凯,翁建峰,郝转芳,李新海,李明顺,张德贵,白丽,张世煌,薛吉全,谢传晓. 玉米科学. 2012(01)
[5]玉米弯孢病菌毒素的研究进展[J]. 张欣芳,苏前富,宋淑云,张伟,李红,刘影,晋齐鸣. 玉米科学. 2009(06)
[6]寄主抗性胁迫下玉米弯孢叶斑病菌致病力相关蛋白与基因表达的分析[J]. 周斐红,刘力行,陈捷,姜雪,刘铜,黄秀丽,翟羽红. 自然科学进展. 2009(09)
[7]几种植物转基因表达载体的构建方法[J]. 林春晶,韦正乙,蔡勤安,侯敬尧,邢少辰. 生物技术. 2008(05)
[8]不同抗性玉米自交系对玉米弯孢菌侵染应答反应差异蛋白分析[J]. 黄秀丽,刘力行,翟羽红,刘铜,陈捷. 自然科学进展. 2008(10)
[9]非核糖体肽合成酶（NRPSs）作用机理与应用的研究进展[J]. 王世媛. 微生物学报. 2007(04)
[10]玉米弯孢菌黑色素性质及其在致病性中的作用研究[J]. 王晓飞,薛春生,徐书法,刘力行,陈捷. 安徽农业科学. 2007(21)
博士论文
[1]铁离子通道关键酶基因ClNPS6和ClFtr1调控玉米弯孢叶斑病菌致病力的分子机制[D]. 路媛媛.沈阳农业大学 2018
[2]clvelB和clt-1基因调控玉米弯孢叶斑病菌毒素合成的分子基础研究[D]. 高金欣.上海交通大学 2017
[3]辣椒疫霉（Phytophthora capsici）5个果胶甲基酯酶基因克隆及pcpme1的功能研究[D]. 贾永健.山东农业大学 2008
硕士论文
[1]苹果树腐烂病菌NRPS基因VmG10的功能研究[D]. 孙红云.西北农林科技大学 2019
[2]NRPS-A在侧孢短芽孢杆菌S62-9抗菌肽生物合成中的功能分析[D]. 刘洋.河北农业大学 2018
[3]稻曲病菌NRPS2与NRPS6基因的功能研究[D]. 韩雨.西北农林科技大学 2018
[4]吡啶霉素中NRPS模块PyrG的功能研究[D]. 李丽丽.上海交通大学 2012
[5]玉米弯孢霉叶斑病菌Clm1基因的克隆与功能分析[D]. 王嘉渊.上海交通大学 2011
本文编号：3455088
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