大豆疫霉纤维二糖水解酶PsGH7a的功能和应用潜力研究

发布时间：2021-10-26 23:57

　　大豆疫霉（Phytophthora sojae）属藻物界（Chromista）卵菌门（Oomycota）菌物,虽然形态上类似丝状真菌,但在系统发育和进化背景上与硅藻和蓝藻接近。在田间,大豆疫霉进化迅速,毒力结构变异频繁,目前大豆疫霉基本已经攻克了所有已知的大豆抗疫霉根腐病基因,急需开发新的抗性资源。因此,深入研究大豆疫霉的致病机理对于发掘分子育种新资源和设计防治策略具有重要的价值。细胞壁是植物抵抗致病菌侵染的强大物理屏障,其复杂异质的高分子动态网络结构是形成抗性屏障的分子基础。感染初期的病原菌通常会分泌多种破坏宿主细胞的细胞壁降解酶（Cell-wall degrading enzymes,CWDEs）。纤维素是植物细胞壁的主要成分（约占40%-60%）,所以病原菌分泌的纤维素酶在细胞壁降解中起着关键的作用。本研究从大豆疫霉中筛选到一个新的GH7家族纤维二糖水解酶基因PsGH7a,其在大豆-疫霉菌互作初期显著上调表达,并且酶蛋白在疫霉中高度保守。已有报道,病原菌分泌的纤维素酶是触发植物免疫应答的病原相关的分子模式（Pathogen-associated molecular pattern... 

【文章来源】：山东农业大学山东省

【文章页数】：72 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 大豆疫霉与植物的互作机制
        1.1.1 大豆疫霉的生物特性
        1.1.2 大豆疫霉的发病症状及规律
        1.1.3 大豆疫霉的致病机制
        1.1.4 大豆的抗病机制
    1.2 细胞壁在植物免疫中的作用
        1.2.1 细胞壁的结构组分
        1.2.2 植物免疫中细胞壁的动态变化
    1.3 CRISPR/Cas9基因编辑系统
        1.3.1 CRISPR/Cas9的研究进展
        1.3.2 卵菌CRISPR/Ca9的研究进展
    1.4 目的意义及技术路线
        1.4.1 目的意义
        1.4.2 技术路线
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 实验菌株及植物
        2.1.2 载体和菌株
        2.1.3 常用的生化试剂
        2.1.4 试验仪器和耗材
        2.1.5 常用培养基和相关溶液的配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 生物信息学分析
        2.2.2 大豆疫霉P6497总RNA的提取
        2.2.3 大豆疫霉反转录cDNA
        2.2.4 荧光定量分析(qRT-PCR)
        2.2.5 引物设计
        2.2.6 大豆疫霉gDNA的提取
        2.2.7 基因的克隆
        2.2.8 琼脂糖凝胶电泳
        2.2.9 目的片段回收
        2.2.10 DNA双酶切
        2.2.11 T4连接
        2.2.12 大肠杆菌转化
        2.2.13 菌落PCR验证
        2.2.14 质粒提取
        2.2.15 质粒线性化和回收
        2.2.16 毕赤酵母感受态的制备
        2.2.17 酵母工程菌筛选
        2.2.18 蛋白表达
        2.2.19 Western-Blot蛋白检测
        2.2.20 点突变
        2.2.21 台盼蓝染色
        2.2.22 CRISP/Cas9基因编辑
            2.2.22.1 sgRNA质粒的构建
            2.2.22.2 pBluescript Ⅱ KS+重组载体的构建
            2.2.22.3 使用CRISPR/Cas9敲除体系对PsGH7a进行基因敲除
3 结果与分析
    3.1 PsGH7a的序列分析
        3.1.1 信号肽预测
        3.1.2 构建PsGH7a蛋白系统发育树
    3.2 鉴定大豆疫霉侵染初期PsGH7a的表达模式
    3.3 PsGH7a真核表达载体构建
        3.3.1 目的基因克隆
        3.3.2 构建pPIC9k::PsGH7a真核表达载体
    3.4 工程菌筛选验证及蛋白表达
        3.4.1 工程菌筛选
        3.4.2 蛋白表达
        3.4.3 酶活性检测
    3.5 蛋白激发子活性测定
    3.6 点突变
        3.6.1 PsGH7a的三维结构模型
        3.6.2 酶活位点突变
        3.6.3 突变酶的表达
        3.6.4 突变酶活性测定
    3.7 蛋白和突变酶蛋白瞬时表达
    3.8 利用CRISPR/Cas9敲除PsGH7a
        3.8.1 设计sgRNA
        3.8.2 R2NW菌株中PsGH7a序列的上下游碱基序列的测序结果
        3.8.3 大豆疫霉PsGH7a敲除及转化子验证
        3.8.4 大豆疫霉P6497敲除转化子的致病性检测
            3.8.4.1 大豆疫霉P6497敲除转化子对大豆下胚轴的致病性检测
            3.8.4.2 大豆疫霉P6497敲除转化子对大豆叶片的致病性检测
4 结论与讨论
    4.1 结论
    4.2 讨论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]大豆种子分泌物对大豆疫霉发育行为的影响及其与品种抗病性关系[J]. 文景芝,徐莹,张卓群,宋光梅,陈宇飞,赵钰琦,高新颖,贾梦瑱,朱加楠.  东北农业大学学报. 2018(10)
[2]植物次生细胞壁加厚过程的转录调控[J]. 朱晓博,张贵粉,陈鹏.  植物生理学报. 2017(09)
[3]野生大豆资源对大豆疫病抗病性和耐病性鉴定[J]. 钟超,李银萍,孙素丽,刘章雄,邱丽娟,朱振东.  植物遗传资源学报. 2015(04)
[4]中国大豆产业状况和观点思考[J]. 杨树果,何秀荣.  中国农村经济. 2014(04)
[5]Self-processing of ribozyme-flanked RNAs into guide RNAs in vitro and in vivo for CRISPR-mediated genome editing[J]. Yangbin Gao,Yunde Zhao.  Journal of Integrative Plant Biology. 2014(04)
[6]β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性与大豆对疫霉根腐病抗性的关系[J]. 左豫虎,康振生,杨传平,芮海英,娄树宝,刘惕若.  植物病理学报. 2009(06)
[7]中国大豆疫霉菌分布及毒力多样性研究[J]. 朱振东,王化波,王晓鸣,常汝镇,武小菲.  中国农业科学. 2003(07)

博士论文
[1]CRISPR/Cas9系统介导的棉花GhCLA1和GhVP基因编辑的研究[D]. 陈修贵.华中农业大学 2017
[2]疫霉菌一个新病原相关模式分子PsXEG1的鉴定和功能分析[D]. 马振川.南京农业大学 2015
[3]大豆对疫病的抗性评价、抗病基因挖掘及候选基因分析[D]. 张吉清.中国农业科学院 2013

硕士论文
[1]山东省大豆疫霉的鉴定及生物学特性研究[D]. 代玉立.安徽农业大学 2011



本文编号：3460448