菊花白锈病防御相关基因CmWRKY15-1的功能研究
发布时间：2021-11-01 11:21
菊花（Chrysanthemum morifolium）是菊科、菊属的多年生草本花卉,是我国的传统名花,具有较高的观赏与经济价值,但菊花在复杂多变的生长过程中,干旱、高温、冻害、高盐等逆境胁迫会影响其生长发育,甚至导致死亡。菊花白色锈病是菊花首要病害之一,尤其在温度较低、湿度较高的环境栽培,植株发病较重,严重影响其产量与品质。近年来,随着植物基因工程技术的发展,从分子层面上改变植物抗逆性的例子屡见不鲜,因此寻找菊花抗逆基因,通过植物遗传工程将特异基因导入植物,进行转基因育种,成为培育抗逆菊花新品种的一条有效途径。本研究以菊花白色锈病抗病品种‘黄莺’为试验材料,利用前期克隆获得的CmWRKY15-1基因序列,构建基因植物表达载体与干扰载体转化菊花,实现该基因的过表达与沉默,验证CmWRKY15-1基因在菊花抗白色锈病中的功能,为阐述其抗白色锈病的分子机理提供借鉴,从而提高菊花的观赏品质。主要研究结果如下:1.农杆菌介导法转化菊花品种‘黄莺’,用含有CmWRKY15-1基因表达载体pBI121-CmWRKY15-1重组质粒的农杆菌菌液侵染叶片,建立高效的遗传转化体系。‘黄莺’在MS+0.5...
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
生长调节剂对菊花品种‘黄莺’叶片分化的影响
第二章CmWRKY15-1基因过量表达载体的转化20图2-2Kan对菊花品种‘黄莺’愈伤组织生长的影响Figure2-2Effectsofkanamycinconcentrationonleafdifferentiationofchrysanthemumvarieties‘Huangying’2.3.3遗传转化体系的确定本试验采用农杆菌介导的叶盘转化法对菊花品种‘黄莺’进行遗传转化，通过控制变量法，经过预培养、共培养、延迟培养、抗性芽的分化和筛癣根的分化和生长等5个阶段确立了该菊花品种的最佳遗传转化体系：预培养（MS+0.5mg·L-16-BA+0.3mg·L-1NAA）2d，侵染时菌液浓度OD600=0.5-0.6，稀释50倍，侵染7min，共培养（MS+0.5mg·L-16-BA+0.3mg·L-1NAA）2d（图2-3a），延迟培养（MS+0.5mg·L-16-BA+0.3mg·L-1NAA+200mg·L-1Cef）2d后，转接至筛选培养基（MS+0.5mg·L-16-BA+0.3mg·L-1NAA+200mg·L-1Cef+20mg·L-1Kan）上，每15d更换一次培养基，直至产生抗性芽后接种于生根筛选培养基（MS+15mg·L-1Kan）中（图2-3b和2-3c），待小苗长至5-8cm时（图2-3d），将获得的转化苗移栽至花盆中，图为整个遗传转化过程。abcda：共培养的菊花叶片；b：形成愈伤组织和筛选培养基长出抗性芽；c：生根培养；d：炼苗a：Leafdisksofco-cultured；b：TheleafdiskswithcallusformationandResistantbudsgeneratedfromtheinfectedleafdiscs；3：Rootingculture；4：Exercisingplants图2-3抗性植株的获得Figure2-3AcquisitionofKanamycin-resistantplants2.3.4转基因菊花的鉴定经过Kan筛选共获得18株抗性植株，提取抗性苗叶片DNA，以pBI121质粒上35S启动子特异引物nptⅡ抗性标记基因序列设计引物，进行PCR鉴定，通过对电泳（图2-4）结果的分析，发现在678bp处有8株扩增出与阳性对照相一致的条带，而阴性对照未见对应条带，表明CmWRKY15-1已基
沈阳农业大学硕士学位论文21个菊花‘黄莺’植株中。M：DNAmarker;W：野生型；P：pBI121阳性质粒DNA；1-18：抗性植株叶片DNAM：DNAmarker；W：Negativecontrol；P：TheplasmidofpBI121aspositivecontrol；1-18：strainsofpupativetransgenic图2-4PCR检测Figure2-4PCRdetection将PCR鉴定出的阳性植株进行半定量检测，结果表明（图2-5），CmWRKY15-1基因在转基因株系中均有不同程度的表达，且均高于野生型植株。WT：野生型；6，7，9，10，11，13，14，16：CmWRKY15-1转基因株系WT：wildtype；6，7，9，10，11，13，14，16：transgenicoverexpressingplantsofCmWRKY15-1图2-5半定量检测Figure2-5SemiquantitativeRT-PCRdetectionqRT-PCR结果显示（图2-6），转基因株系9号中CmWRKY15-1的表达量最高，约为野生型植株的25倍，7号与13号次之，分别为13倍和12倍。荧光定量检测结果与半定量结果一致，由此证明CmWRKY15-1成功高表达。WT：野生型；7，9，13，16：CmWRKY15-1转基因株系WT：wildtype；7，9，13，16：transgenicoverexpressingplantsofCmWRKY15-1图2-6野生型与转基因株系中CmWRKY15-1的相对表达量Figure2-6RelativeexpressionlevelofCmWRKY15-1intransgeniclinesandWT2.3.5阳性植株的扩繁
【参考文献】：
期刊论文
[1]农杆菌介导的黑果枸杞遗传转化体系的建立[J]. 王静,唐静,崔悦婷,陈韵,赵会君,闫兴富. 北方园艺. 2020(01)
[2]WRKY转录因子在植物非生物胁迫抗逆育种中的应用[J]. 司爱君,陈红,余渝,孔宪辉,刘丽,王旭文,田琴. 江苏农业科学. 2019(16)
[3]菊花‘金不凋’再生及遗传转化体系的构建[J]. 吴志苹,高亦珂,范敏,高耀辉. 分子植物育种. 2020(01)
[4]中国农科院利用植物介导的RNAi方法获得抗蚜虫小麦[J]. 郑庆伟. 农药市场信息. 2019(03)
[5]棉花WRKY22基因分离及其对黄萎病的抗性分析[J]. 雷煜,张振楠,胡广,刘建芬,唐叶,张宁,司怀军,吴家和. 华北农学报. 2018(06)
[6]WRKY转录因子在植物抗病反应中的功能研究进展[J]. 禹阳,贾赵东,马佩勇,郭小丁,谢一芝,边小峰. 分子植物育种. 2018(21)
[7]RNAi技术及其在植物中的应用[J]. 伍国强,刘海龙,刘左军. 分子植物育种. 2018(19)
[8]菊花白锈病的药剂防治试验[J]. 赵娅玲,马千里,程东美. 仲恺农业工程学院学报. 2017(04)
[9]WRKY转录因子在植物抗逆生理中的研究进展[J]. 文锋,吴小祝,廖亮,刘新圣,李鹏. 广西植物. 2017(01)
[10]过量表达棉花CBF2基因提高转基因拟南芥抗旱耐盐能力[J]. 陈芸,郑勇,刘霞,任羽,马刘峰. 植物科学学报. 2016(06)
博士论文
[1]大麦水杨酸合成途径及其应答赤霉菌侵染的机理研究[D]. 郝群群.山东农业大学 2018
[2]拟南芥水杨酸通路蛋白参与植物抗生物胁迫的作用机理研究[D]. 朱杉.兰州大学 2012
硕士论文
[1]菊花CmDREBa-2基因的同源转化及功能验证[D]. 李娜（Lee Na）.沈阳农业大学 2018
[2]菊花抗白色锈病相关基因CmDREBa-2的克隆及表达分析[D]. 熊超明.沈阳农业大学 2018
[3]CsSAMT-1基因在水杨酸信号响应柑橘黄龙病侵染中的功能研究[D]. 白晓晶.西南大学 2018
[4]菊花CmMET1基因RNAi载体的构建及对菊花和青蒿的遗传转化[D]. 范晓萱.河南大学 2016
[5]烟草orf25、atp9基因的RNAi载体构建及遗传转化[D]. 谢丽娟.江西农业大学 2016
[6]菊花CmWRKY1和CmWRKY15基因功能初步研究[D]. 范青青.南京农业大学 2016
[7]海岛棉GbNPR1基因的表达特性及功能分析[D]. 柴蒙亮.石河子大学 2014
[8]2012年我国小麦叶锈菌生理小种鉴定及毒性分析[D]. 肖宇.河北农业大学 2014
[9]外源性水杨酸诱导月季对黑斑病抗性的研究[D]. 金一锋.东北农业大学 2013
[10]水稻Hsp74.8基因的初步功能研究和两个水稻MYB基因的过表达载体构建[D]. 王景晨.湖南农业大学 2011
本文编号：3470023
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
生长调节剂对菊花品种‘黄莺’叶片分化的影响
第二章CmWRKY15-1基因过量表达载体的转化20图2-2Kan对菊花品种‘黄莺’愈伤组织生长的影响Figure2-2Effectsofkanamycinconcentrationonleafdifferentiationofchrysanthemumvarieties‘Huangying’2.3.3遗传转化体系的确定本试验采用农杆菌介导的叶盘转化法对菊花品种‘黄莺’进行遗传转化，通过控制变量法，经过预培养、共培养、延迟培养、抗性芽的分化和筛癣根的分化和生长等5个阶段确立了该菊花品种的最佳遗传转化体系：预培养（MS+0.5mg·L-16-BA+0.3mg·L-1NAA）2d，侵染时菌液浓度OD600=0.5-0.6，稀释50倍，侵染7min，共培养（MS+0.5mg·L-16-BA+0.3mg·L-1NAA）2d（图2-3a），延迟培养（MS+0.5mg·L-16-BA+0.3mg·L-1NAA+200mg·L-1Cef）2d后，转接至筛选培养基（MS+0.5mg·L-16-BA+0.3mg·L-1NAA+200mg·L-1Cef+20mg·L-1Kan）上，每15d更换一次培养基，直至产生抗性芽后接种于生根筛选培养基（MS+15mg·L-1Kan）中（图2-3b和2-3c），待小苗长至5-8cm时（图2-3d），将获得的转化苗移栽至花盆中，图为整个遗传转化过程。abcda：共培养的菊花叶片；b：形成愈伤组织和筛选培养基长出抗性芽；c：生根培养；d：炼苗a：Leafdisksofco-cultured；b：TheleafdiskswithcallusformationandResistantbudsgeneratedfromtheinfectedleafdiscs；3：Rootingculture；4：Exercisingplants图2-3抗性植株的获得Figure2-3AcquisitionofKanamycin-resistantplants2.3.4转基因菊花的鉴定经过Kan筛选共获得18株抗性植株，提取抗性苗叶片DNA，以pBI121质粒上35S启动子特异引物nptⅡ抗性标记基因序列设计引物，进行PCR鉴定，通过对电泳（图2-4）结果的分析，发现在678bp处有8株扩增出与阳性对照相一致的条带，而阴性对照未见对应条带，表明CmWRKY15-1已基
沈阳农业大学硕士学位论文21个菊花‘黄莺’植株中。M：DNAmarker;W：野生型；P：pBI121阳性质粒DNA；1-18：抗性植株叶片DNAM：DNAmarker；W：Negativecontrol；P：TheplasmidofpBI121aspositivecontrol；1-18：strainsofpupativetransgenic图2-4PCR检测Figure2-4PCRdetection将PCR鉴定出的阳性植株进行半定量检测，结果表明（图2-5），CmWRKY15-1基因在转基因株系中均有不同程度的表达，且均高于野生型植株。WT：野生型；6，7，9，10，11，13，14，16：CmWRKY15-1转基因株系WT：wildtype；6，7，9，10，11，13，14，16：transgenicoverexpressingplantsofCmWRKY15-1图2-5半定量检测Figure2-5SemiquantitativeRT-PCRdetectionqRT-PCR结果显示（图2-6），转基因株系9号中CmWRKY15-1的表达量最高，约为野生型植株的25倍，7号与13号次之，分别为13倍和12倍。荧光定量检测结果与半定量结果一致，由此证明CmWRKY15-1成功高表达。WT：野生型；7，9，13，16：CmWRKY15-1转基因株系WT：wildtype；7，9，13，16：transgenicoverexpressingplantsofCmWRKY15-1图2-6野生型与转基因株系中CmWRKY15-1的相对表达量Figure2-6RelativeexpressionlevelofCmWRKY15-1intransgeniclinesandWT2.3.5阳性植株的扩繁
【参考文献】：
期刊论文
[1]农杆菌介导的黑果枸杞遗传转化体系的建立[J]. 王静,唐静,崔悦婷,陈韵,赵会君,闫兴富. 北方园艺. 2020(01)
[2]WRKY转录因子在植物非生物胁迫抗逆育种中的应用[J]. 司爱君,陈红,余渝,孔宪辉,刘丽,王旭文,田琴. 江苏农业科学. 2019(16)
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[4]中国农科院利用植物介导的RNAi方法获得抗蚜虫小麦[J]. 郑庆伟. 农药市场信息. 2019(03)
[5]棉花WRKY22基因分离及其对黄萎病的抗性分析[J]. 雷煜,张振楠,胡广,刘建芬,唐叶,张宁,司怀军,吴家和. 华北农学报. 2018(06)
[6]WRKY转录因子在植物抗病反应中的功能研究进展[J]. 禹阳,贾赵东,马佩勇,郭小丁,谢一芝,边小峰. 分子植物育种. 2018(21)
[7]RNAi技术及其在植物中的应用[J]. 伍国强,刘海龙,刘左军. 分子植物育种. 2018(19)
[8]菊花白锈病的药剂防治试验[J]. 赵娅玲,马千里,程东美. 仲恺农业工程学院学报. 2017(04)
[9]WRKY转录因子在植物抗逆生理中的研究进展[J]. 文锋,吴小祝,廖亮,刘新圣,李鹏. 广西植物. 2017(01)
[10]过量表达棉花CBF2基因提高转基因拟南芥抗旱耐盐能力[J]. 陈芸,郑勇,刘霞,任羽,马刘峰. 植物科学学报. 2016(06)
博士论文
[1]大麦水杨酸合成途径及其应答赤霉菌侵染的机理研究[D]. 郝群群.山东农业大学 2018
[2]拟南芥水杨酸通路蛋白参与植物抗生物胁迫的作用机理研究[D]. 朱杉.兰州大学 2012
硕士论文
[1]菊花CmDREBa-2基因的同源转化及功能验证[D]. 李娜（Lee Na）.沈阳农业大学 2018
[2]菊花抗白色锈病相关基因CmDREBa-2的克隆及表达分析[D]. 熊超明.沈阳农业大学 2018
[3]CsSAMT-1基因在水杨酸信号响应柑橘黄龙病侵染中的功能研究[D]. 白晓晶.西南大学 2018
[4]菊花CmMET1基因RNAi载体的构建及对菊花和青蒿的遗传转化[D]. 范晓萱.河南大学 2016
[5]烟草orf25、atp9基因的RNAi载体构建及遗传转化[D]. 谢丽娟.江西农业大学 2016
[6]菊花CmWRKY1和CmWRKY15基因功能初步研究[D]. 范青青.南京农业大学 2016
[7]海岛棉GbNPR1基因的表达特性及功能分析[D]. 柴蒙亮.石河子大学 2014
[8]2012年我国小麦叶锈菌生理小种鉴定及毒性分析[D]. 肖宇.河北农业大学 2014
[9]外源性水杨酸诱导月季对黑斑病抗性的研究[D]. 金一锋.东北农业大学 2013
[10]水稻Hsp74.8基因的初步功能研究和两个水稻MYB基因的过表达载体构建[D]. 王景晨.湖南农业大学 2011
本文编号：3470023
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