布鲁氏菌快速核酸检测方法的建立
发布时间：2021-11-13 17:06
布鲁氏菌病（Brucellosis,简称“布病”）是由胞内寄生菌——布鲁氏菌（Brucella spp.）引起的一种人兽共患传染病,该病严重影响我国的畜牧业的发展,造成重大经济损失。我国目前对布鲁氏菌病的检测主要以细菌学、血清学检测方法为主,这些方法存在着费时费力、假阳性、以及无法区分死菌等缺点,同时不能对病原进行快速检测和种间鉴定。因此,开发布鲁氏菌病快速检测方法对布病的防控与净化具有重要意义。本课题致力于研究布鲁氏菌的快速检测方法,以核酸扩增技术为基础,建立一系列检测方法,为布鲁氏菌病的科学研究、防控与净化,提供切实有效的布鲁氏菌检测技术手段。1、通过将叠氮溴化丙锭（Propidium Monoazide,PMA）与荧光定量PCR（Fluorescence Quantitative PCR,qPCR）结合建立一种布鲁氏菌活菌数的快速定量检测方法。以布鲁氏菌单拷贝BCSP31基因为检测靶标,构建重组标准质粒,绘制标准曲线。优化qPCR反应条件及PMA最佳应用浓度与曝光时间,对该方法的灵敏度、特异性、重复性等进行分析。结果显示,CT值与标准质粒拷贝数浓度对数值之间线性关系良好;灵敏度为...
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：118 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Bruce-ladder法对布鲁氏菌进行种间鉴定[85]
第一篇文献综述第2章基于核酸扩增技术的检测方法及其应用16基团，对整个扩增过程进行实时监控，将每个扩增反应所产生的荧光信号进行检测、收集，最终利用已知量的标准品构建标准曲线对未知样本进行定量分析，实现了PCR从定性到定量的飞跃。该技术目前常用的荧光物质主要分为探针类和染料类两大类。1）TaqMan探针TaqMan探针是一段能与目的片段特异结合的核酸序列，如图2所示，该序列的5"标记荧光报告基团，3"端标记淬灭基团，探针处于完整状态时，荧光基团所释放的荧光信号被淬灭基团所吸收。当扩增反应开始时，引物与探针都与模板链特异性结合，随着扩增反应的开始，探针链逐渐被链置换反应所替代，探针将会被DNA聚合酶的5"-3"外切酶活性所水解，此时荧光基团释放的荧光信号就会随着扩增反应的进行被仪器监测。荧光信号的强度达到仪器所设置的某一阈值时，此时的循环次数（CT值）就被记录下来，CT值与目的基因拷贝数的对数值成线性关系，从而对目标物达到定量的目的[98]。图2TaqMan探针技术作用原理[99]Fig.2TheprincipleofTaqManProbetechnology2）杂交探针（HybProbe）杂交探针是由两个寡核苷酸探针所组成，该探针率先由罗氏公司（Roche）所发明并应用于荧光定量PCR的检测。如图3所示，两个寡核苷酸探针分别标记荧光供体和荧光受体，当PCR反应退火复性时，两个探针同与一条模板链进行杂交，荧光供体与荧光受体相接近，荧光供体被外来光源激发，其释放的能量
第一篇文献综述第2章基于核酸扩增技术的检测方法及其应用17通过荧光共振能量转移（FRET）传递给荧光受体，而受体所释放的荧光信号则被仪器检测到，随着扩增反应的进行，DNA产物越多，其释放的荧光信号就越大，从而对目标物达到定量的目的图3杂交探针技术作用原理（引自Roche公司）Fig.3TheprincipleofHybridizationProbetechnology3）分子信标探针（MulecularBeaconsProbe）分子信标探针为新型探针，该探针需要特定结构的序列，设计要求高。特点在于其为茎环状的发卡结构，如图4所示。该探针的茎环是由15~30个核苷酸组成，茎臂一般由5~7个核苷酸组成，其两端序列互补配对，分别标记有荧光基团和淬灭集团。当无靶标时，探针成自由状态，形成稳定的茎环发卡结构，荧光基团被激发产生的荧光信号被淬灭集团所淬灭，当探针与模板链成功杂交时，可形成线性结构，荧光基团与淬灭基团间隔较远，淬灭基团失去作用，此时所激发的荧光信号可被仪器监测到。图4分子信标探针技术作用原理（引自Roche公司）Fig.4TheprincipleofMulecularBeaconsProbetechnology4）荧光染料荧光染料的工作原理较简单，如图5所示，当荧光染料与双链扩增产物结合时，会产生较强的荧光信号，进而被仪器监测到，荧光信号的强度与反应体系内
【参考文献】：
期刊论文
[1]羊布鲁氏菌病的危害及防控[J]. 宋小会. 饲料博览. 2019(01)
[2]布病防治知识[J]. 智艳丽. 四川畜牧兽医. 2018(12)
[3]我国人畜间布鲁氏菌病流行状况[J]. 陈礼朋,张淼,李新生,卢俊刚. 中国动物检疫. 2018(10)
[4]规模化牛羊场布鲁氏杆菌病净化的注意环节[J]. 王宝菊. 养殖与饲料. 2018(06)
[5]2005-2016年全国布鲁氏菌病监测数据分析[J]. 崔步云,姜海. 疾病监测. 2018(03)
[6]马耳他布鲁菌椎管内感染性肉芽肿一例[J]. 杜川,胡超,朱筱,李铮,赵龙,唐晓平. 中华神经外科杂志. 2017 (11)
[7]羊布鲁氏菌病的特点及综合防治[J]. 韩冬青. 甘肃畜牧兽医. 2017(06)
[8]家畜布鲁氏菌病及其防控措施[J]. 普会玲. 中国畜牧兽医文摘. 2017(04)
[9]有机消泡剂对棘孢木霉菌株Tr148c液体发酵分生孢子产量的影响[J]. 马晓梅,王军,旷文丰,褚凯,陈晨,毛伟力. 化学与生物工程. 2017(03)
[10]间接酶联免疫吸附试验在人布鲁菌病诊断中的价值研究[J]. 何晶晶,刘景瑶,张雁,赵冬梅,郑遵荣. 诊断学理论与实践. 2017(01)
博士论文
[1]动物布鲁氏菌快速检测方法的研究[D]. 李建云.内蒙古农业大学 2012
[2]吉林省布鲁氏菌流行株种属鉴定及其耐药分子机制的研究[D]. 孙丽媛.吉林大学 2011
硕士论文
[1]非洲猪瘟病毒重组酶聚合酶扩增（RPA）方法的建立[D]. 哈登楚日亚.内蒙古农业大学 2017
[2]牛布鲁氏菌病荧光标记免疫层析试纸条检测技术研究[D]. 吴彤.内蒙古农业大学 2016
[3]基于PCR的天麻、Hg2+检测方法及PCR结合DiSC2（5）的一步可视化检测法的建立[D]. 王巍.成都中医药大学 2015
[4]牛羊猪犬种布鲁氏菌多重PCR方法的建立及试剂盒研制[D]. 陈思.中国人民解放军军事医学科学院 2014
[5]循环探针荧光定量PCR方法用于布鲁氏菌分种的研究以及布鲁氏菌LAMP可视化检测方法的建立[D]. 许邹亮.扬州大学 2011
[6]布鲁氏菌荧光定量PCR快速检测方法的建立及检测试剂盒的组装[D]. 李光辉.吉林大学 2006
本文编号：3493385
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：118 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Bruce-ladder法对布鲁氏菌进行种间鉴定[85]
第一篇文献综述第2章基于核酸扩增技术的检测方法及其应用16基团，对整个扩增过程进行实时监控，将每个扩增反应所产生的荧光信号进行检测、收集，最终利用已知量的标准品构建标准曲线对未知样本进行定量分析，实现了PCR从定性到定量的飞跃。该技术目前常用的荧光物质主要分为探针类和染料类两大类。1）TaqMan探针TaqMan探针是一段能与目的片段特异结合的核酸序列，如图2所示，该序列的5"标记荧光报告基团，3"端标记淬灭基团，探针处于完整状态时，荧光基团所释放的荧光信号被淬灭基团所吸收。当扩增反应开始时，引物与探针都与模板链特异性结合，随着扩增反应的开始，探针链逐渐被链置换反应所替代，探针将会被DNA聚合酶的5"-3"外切酶活性所水解，此时荧光基团释放的荧光信号就会随着扩增反应的进行被仪器监测。荧光信号的强度达到仪器所设置的某一阈值时，此时的循环次数（CT值）就被记录下来，CT值与目的基因拷贝数的对数值成线性关系，从而对目标物达到定量的目的[98]。图2TaqMan探针技术作用原理[99]Fig.2TheprincipleofTaqManProbetechnology2）杂交探针（HybProbe）杂交探针是由两个寡核苷酸探针所组成，该探针率先由罗氏公司（Roche）所发明并应用于荧光定量PCR的检测。如图3所示，两个寡核苷酸探针分别标记荧光供体和荧光受体，当PCR反应退火复性时，两个探针同与一条模板链进行杂交，荧光供体与荧光受体相接近，荧光供体被外来光源激发，其释放的能量
第一篇文献综述第2章基于核酸扩增技术的检测方法及其应用17通过荧光共振能量转移（FRET）传递给荧光受体，而受体所释放的荧光信号则被仪器检测到，随着扩增反应的进行，DNA产物越多，其释放的荧光信号就越大，从而对目标物达到定量的目的图3杂交探针技术作用原理（引自Roche公司）Fig.3TheprincipleofHybridizationProbetechnology3）分子信标探针（MulecularBeaconsProbe）分子信标探针为新型探针，该探针需要特定结构的序列，设计要求高。特点在于其为茎环状的发卡结构，如图4所示。该探针的茎环是由15~30个核苷酸组成，茎臂一般由5~7个核苷酸组成，其两端序列互补配对，分别标记有荧光基团和淬灭集团。当无靶标时，探针成自由状态，形成稳定的茎环发卡结构，荧光基团被激发产生的荧光信号被淬灭集团所淬灭，当探针与模板链成功杂交时，可形成线性结构，荧光基团与淬灭基团间隔较远，淬灭基团失去作用，此时所激发的荧光信号可被仪器监测到。图4分子信标探针技术作用原理（引自Roche公司）Fig.4TheprincipleofMulecularBeaconsProbetechnology4）荧光染料荧光染料的工作原理较简单，如图5所示，当荧光染料与双链扩增产物结合时，会产生较强的荧光信号，进而被仪器监测到，荧光信号的强度与反应体系内
【参考文献】：
期刊论文
[1]羊布鲁氏菌病的危害及防控[J]. 宋小会. 饲料博览. 2019(01)
[2]布病防治知识[J]. 智艳丽. 四川畜牧兽医. 2018(12)
[3]我国人畜间布鲁氏菌病流行状况[J]. 陈礼朋,张淼,李新生,卢俊刚. 中国动物检疫. 2018(10)
[4]规模化牛羊场布鲁氏杆菌病净化的注意环节[J]. 王宝菊. 养殖与饲料. 2018(06)
[5]2005-2016年全国布鲁氏菌病监测数据分析[J]. 崔步云,姜海. 疾病监测. 2018(03)
[6]马耳他布鲁菌椎管内感染性肉芽肿一例[J]. 杜川,胡超,朱筱,李铮,赵龙,唐晓平. 中华神经外科杂志. 2017 (11)
[7]羊布鲁氏菌病的特点及综合防治[J]. 韩冬青. 甘肃畜牧兽医. 2017(06)
[8]家畜布鲁氏菌病及其防控措施[J]. 普会玲. 中国畜牧兽医文摘. 2017(04)
[9]有机消泡剂对棘孢木霉菌株Tr148c液体发酵分生孢子产量的影响[J]. 马晓梅,王军,旷文丰,褚凯,陈晨,毛伟力. 化学与生物工程. 2017(03)
[10]间接酶联免疫吸附试验在人布鲁菌病诊断中的价值研究[J]. 何晶晶,刘景瑶,张雁,赵冬梅,郑遵荣. 诊断学理论与实践. 2017(01)
博士论文
[1]动物布鲁氏菌快速检测方法的研究[D]. 李建云.内蒙古农业大学 2012
[2]吉林省布鲁氏菌流行株种属鉴定及其耐药分子机制的研究[D]. 孙丽媛.吉林大学 2011
硕士论文
[1]非洲猪瘟病毒重组酶聚合酶扩增（RPA）方法的建立[D]. 哈登楚日亚.内蒙古农业大学 2017
[2]牛布鲁氏菌病荧光标记免疫层析试纸条检测技术研究[D]. 吴彤.内蒙古农业大学 2016
[3]基于PCR的天麻、Hg2+检测方法及PCR结合DiSC2（5）的一步可视化检测法的建立[D]. 王巍.成都中医药大学 2015
[4]牛羊猪犬种布鲁氏菌多重PCR方法的建立及试剂盒研制[D]. 陈思.中国人民解放军军事医学科学院 2014
[5]循环探针荧光定量PCR方法用于布鲁氏菌分种的研究以及布鲁氏菌LAMP可视化检测方法的建立[D]. 许邹亮.扬州大学 2011
[6]布鲁氏菌荧光定量PCR快速检测方法的建立及检测试剂盒的组装[D]. 李光辉.吉林大学 2006
本文编号：3493385
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