甜瓜果实发育过程中高表达的三个未知功能基因的初步研究
发布时间：2021-11-29 05:38
甜瓜是重要的园艺经济作物,是除了番茄以外的另一种可供选择且非常重要的研究肉质型果实发育的模式植物。本研究以甜瓜品种河套蜜瓜（Cucumis melo L.cv.Hetao melon）作为实验材料,采用分子生物学的研究方法探究了在甜瓜果实发育过程中高表达的三个功能未知基因的特性及果实成熟过程中的作用。主要研究结果如下:⑴根据甜瓜果实的转录组数据筛选得到在甜瓜果实发育过程中高表达的三个功能未知基因:MELO3C015185,MELO3C020745和MELO3C011405。通过生物信息学分析,发现MELO3C015185蛋白为疏水性蛋白,有一个跨膜结构域、无信号肽,亚细胞定位预测该蛋白定位在细胞膜上。MELO3C020745蛋白和MELO3C011405蛋白均为疏水性蛋白,无跨膜结构域、无信号肽。亚细胞定位预测MELO3C020745蛋白定位在细胞质中,MELO3C011405蛋白定位在细胞核中。⑵实时荧光定量PCR检测结果表明,MELO3C015185基因表达量为茎>叶>雄花>生长期果实;MELO3C020745基因表达量在呼吸跃变期果实中最高,雄花中次之;MELO...
【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
乙烯生物合成途径[11]
内蒙古大学硕士学位论文23图2.1pCAMBIA1300(35S-Targetgene-sGFP)重组质粒构建流程Fig.2.1ConstructionofthepCAMBIA1300(35S-Targetgene-sGFP)recombinantplasmid2.2.5.4制备农杆菌（GV3101）感受态⑴在10mLYEB液体培养基中加入200μL活化后的GV3101菌种，28℃恒温摇床以180rpm的速度过夜振荡培养。⑵次日，在50mLYEB（60μg/mL,Rif）液体培养基中加入5mL扩培菌液，28℃恒温摇床，180rpm振荡培养6-7h至OD600=0.5。⑶将50mL菌液放置冰水浴30min，再倒入50mL无菌离心管中，冷冻高速离心机中4℃、5000rpm离心5min，弃上清。⑷用10mLNaCl(0.15mol/L)溶液悬浮细胞，再次在冷冻高速离心机中4℃、5000rpm离心5min，弃上清。
甜瓜果实发育过程中高表达的三个未知功能基因的初步研究26图2.2重组载体Ppzp221-Targetgene构建策略图Fig.2.2TheMapofconstructionofPpzp221-Targetgene2.2.6.3重组质粒的PCR筛选长出的菌落参考2.2.4.3的PCR阳性检测方法进行初步的筛选，得到阳性菌株的重组质粒需要再次进行双酶切验证，进一步验证目的基因是否插入到超表达载体中，且插入片段是否正确。将酶切验证正确的菌株进行扩培，进行保菌放-80℃保存备用。剩余菌液提取质粒并检测质粒的浓度和纯度，并将其命名为：pP-5185、pP-0745和pP-1405，放-20℃保存备用。2.2.7目的基因编辑载体的构建2.2.7.1sgRNA靶位点的选择及接头引物的设计在CRISPR/Cas9技术中，Cas9蛋白通过与向导RNA(singleguideRNA,sgRNA)结合进行基因组编辑靶位点的切割，而Cas9蛋白需要与目的基因上的一段PAM序列结合，使Cas9蛋白与目的基因相连接[101]。在MELO3C015185、MELO3C020745和MELO3C011405基因序列的任一条链内，选择两个具有5-(A/G)N19NGG常规靶位点或具有5-(T/C)N19NGG的非常规靶位点，按照CRISPR/Cas9系统接头引物设计原则设计相应的靶位点引物。根据要求，每个基因需要设计两个编辑靶位点，靶位点位置及序列见图2.3。
【参考文献】：
期刊论文
[1]热激转录因子在植物胁迫应答和生长发育中的作用[J]. 陆伟,耿玉璐,郑宇茜,王幼平,方玉洁. 分子植物育种. 2020(03)
[2]乙烯的生物合成与信号及其对种子萌发和休眠的调控[J]. 宋松泉,刘军,徐恒恒,张琪,黄荟,伍贤进. 作物学报. 2019(07)
[3]乙烯对树莓果实成熟软化的影响[J]. 杨国慧,李红霞,韩德果,范婷婷,陈乐天,李玲. 东北农业大学学报. 2019(03)
[4]植物果实发育成熟相关转录因子的研究进展[J]. 马勇,张红霞,图雅,陈秀莉. 基因组学与应用生物学. 2017(11)
[5]癌症相关基因选择性剪接进化数据库的构建[J]. 徐敏杰,窦同海,徐佳熹,江建平,刘匆,付茂宾,高原,陈诚文,张亮,周雁. 复旦学报(自然科学版). 2016(05)
[6]植物转录因子MYB基因家族的研究进展[J]. 牛义岭,姜秀明,许向阳. 分子植物育种. 2016(08)
[7]转录因子调控果实成熟和衰老机制研究进展[J]. 范中奇,邝健飞,陆旺金,陈建业. 园艺学报. 2015(09)
[8]油菜素内酯在植物生长发育中的作用机制研究进展[J]. 郑洁,王磊. 中国农业科技导报. 2014(01)
[9]新一代测序技术在植物转录组研究中的应用[J]. 梁烨,陈双燕,刘公社. 遗传. 2011(12)
[10]2,4-表油菜素内酯对高温胁迫下甜瓜幼苗抗氧化酶活性和光合作用的影响[J]. 张永平,杨少军,陈幼源. 西北植物学报. 2011(07)
博士论文
[1]园艺作物农户生产行为实证研究[D]. 孙玉竹.中国农业科学院 2018
[2]西瓜果实成熟乙烯调控的生理及分子机制初探[D]. 周明.中国农业科学院 2017
硕士论文
[1]低温弱光对甜瓜幼苗生理特性的影响[D]. 李琦.华中农业大学 2012
本文编号：3525943
【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
乙烯生物合成途径[11]
内蒙古大学硕士学位论文23图2.1pCAMBIA1300(35S-Targetgene-sGFP)重组质粒构建流程Fig.2.1ConstructionofthepCAMBIA1300(35S-Targetgene-sGFP)recombinantplasmid2.2.5.4制备农杆菌（GV3101）感受态⑴在10mLYEB液体培养基中加入200μL活化后的GV3101菌种，28℃恒温摇床以180rpm的速度过夜振荡培养。⑵次日，在50mLYEB（60μg/mL,Rif）液体培养基中加入5mL扩培菌液，28℃恒温摇床，180rpm振荡培养6-7h至OD600=0.5。⑶将50mL菌液放置冰水浴30min，再倒入50mL无菌离心管中，冷冻高速离心机中4℃、5000rpm离心5min，弃上清。⑷用10mLNaCl(0.15mol/L)溶液悬浮细胞，再次在冷冻高速离心机中4℃、5000rpm离心5min，弃上清。
甜瓜果实发育过程中高表达的三个未知功能基因的初步研究26图2.2重组载体Ppzp221-Targetgene构建策略图Fig.2.2TheMapofconstructionofPpzp221-Targetgene2.2.6.3重组质粒的PCR筛选长出的菌落参考2.2.4.3的PCR阳性检测方法进行初步的筛选，得到阳性菌株的重组质粒需要再次进行双酶切验证，进一步验证目的基因是否插入到超表达载体中，且插入片段是否正确。将酶切验证正确的菌株进行扩培，进行保菌放-80℃保存备用。剩余菌液提取质粒并检测质粒的浓度和纯度，并将其命名为：pP-5185、pP-0745和pP-1405，放-20℃保存备用。2.2.7目的基因编辑载体的构建2.2.7.1sgRNA靶位点的选择及接头引物的设计在CRISPR/Cas9技术中，Cas9蛋白通过与向导RNA(singleguideRNA,sgRNA)结合进行基因组编辑靶位点的切割，而Cas9蛋白需要与目的基因上的一段PAM序列结合，使Cas9蛋白与目的基因相连接[101]。在MELO3C015185、MELO3C020745和MELO3C011405基因序列的任一条链内，选择两个具有5-(A/G)N19NGG常规靶位点或具有5-(T/C)N19NGG的非常规靶位点，按照CRISPR/Cas9系统接头引物设计原则设计相应的靶位点引物。根据要求，每个基因需要设计两个编辑靶位点，靶位点位置及序列见图2.3。
【参考文献】：
期刊论文
[1]热激转录因子在植物胁迫应答和生长发育中的作用[J]. 陆伟,耿玉璐,郑宇茜,王幼平,方玉洁. 分子植物育种. 2020(03)
[2]乙烯的生物合成与信号及其对种子萌发和休眠的调控[J]. 宋松泉,刘军,徐恒恒,张琪,黄荟,伍贤进. 作物学报. 2019(07)
[3]乙烯对树莓果实成熟软化的影响[J]. 杨国慧,李红霞,韩德果,范婷婷,陈乐天,李玲. 东北农业大学学报. 2019(03)
[4]植物果实发育成熟相关转录因子的研究进展[J]. 马勇,张红霞,图雅,陈秀莉. 基因组学与应用生物学. 2017(11)
[5]癌症相关基因选择性剪接进化数据库的构建[J]. 徐敏杰,窦同海,徐佳熹,江建平,刘匆,付茂宾,高原,陈诚文,张亮,周雁. 复旦学报(自然科学版). 2016(05)
[6]植物转录因子MYB基因家族的研究进展[J]. 牛义岭,姜秀明,许向阳. 分子植物育种. 2016(08)
[7]转录因子调控果实成熟和衰老机制研究进展[J]. 范中奇,邝健飞,陆旺金,陈建业. 园艺学报. 2015(09)
[8]油菜素内酯在植物生长发育中的作用机制研究进展[J]. 郑洁,王磊. 中国农业科技导报. 2014(01)
[9]新一代测序技术在植物转录组研究中的应用[J]. 梁烨,陈双燕,刘公社. 遗传. 2011(12)
[10]2,4-表油菜素内酯对高温胁迫下甜瓜幼苗抗氧化酶活性和光合作用的影响[J]. 张永平,杨少军,陈幼源. 西北植物学报. 2011(07)
博士论文
[1]园艺作物农户生产行为实证研究[D]. 孙玉竹.中国农业科学院 2018
[2]西瓜果实成熟乙烯调控的生理及分子机制初探[D]. 周明.中国农业科学院 2017
硕士论文
[1]低温弱光对甜瓜幼苗生理特性的影响[D]. 李琦.华中农业大学 2012
本文编号：3525943
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