水稻OsHXK6克隆表达和催化特性研究

发布时间：2022-01-23 01:52

　　己糖激酶（HXK;EC2.7.1.1）同工酶广泛参与植物营养代谢,尤其在水稻根部铵同化相关碳代谢调节上具有重要功能。本研究以水稻9311 （Oryza sativa L. cv indica9311）和珞优8号（Oryza sativa L. cv Luoyou8）为材料,营养液中加入3 mM的α-酮戊二酸或90 mM蔗糖,处理48 h,水稻根部谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase; GS）和谷氨酸合酶（NADH-dependent glutamate synthase; NADH-GOGAT）活性升高,营养液铵离子吸收速率加快。证明α-酮戊二酸或蔗糖处理可促进水稻根部铵同化。活性染色结合荧光定量PCR分析表明α-酮戊二酸提高了根部HXK同工酶活性及其mRNA丰度。说明水稻HXK同工酶是α-酮戊二酸调节水稻根部铵同化的靶标酶。提取水稻9311根部总RNA,逆转录合成第一链cDNA,以此为模板PCR扩增OsHXK6全长片段,PCR产物插入pMD18-T并测序。生物信息学分析表明OsHXK6为单次跨膜蛋白,N端27个氨基酸残基构成跨膜区,截去跨膜区后,预测蛋白质相对分子... 

【文章来源】：华中师范大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1.1 己糖激酶生物化学功能
    1.2 植物己糖激酶家族
        1.2.1 己糖激酶
        1.2.2 葡萄糖激酶
        1.2.3 果糖激酶
    1.3 植物己糖激酶与代谢调控
        1.3.1 植物己糖激酶与糖信号
        1.3.2 植物己糖激酶参与氮同化调控
    1.4 植物己糖激酶基因研究现状
        1.4.1 高等植物己糖激酶同源基因的分离
        1.4.2 高等植物己糖激酶同源基因的结构
        1.4.3 高等植物己糖激酶亚细胞定位
        1.4.4 高等植物己糖激酶同源基因的表达
    1.5 蛋白表达系统
        1.5.1 大肠杆菌表达系统
        1.5.2 酵母表达系统
    1.6 植物己糖激酶生物化学特性
        1.6.1 植物己糖激酶催化特性
        1.6.2 酶抑制剂动力学
        1.6.3 酶稳定性
        1.6.4 植物己糖激酶结构生物学
    1.7 本研究主要内容和意义
第二章 实验材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 水稻种子和工程菌来源
        2.1.2 主要试剂与器材
        2.1.3 主要培养基
        2.1.4 PCR扩增引物
        2.1.5 主要溶液和常用缓冲液
    2.2 实验方法
        2.2.1 水稻培养
        2.2.2 总RNA的提取与cDNA第一链的合成
        2.2.3 荧光定量PCR检测OsHX和OsGlnB转录量
        2.2.4 植物铵同化相关C/N代谢酶活性测定
        2.2.5 植物组织离子浓度测定
        2.2.6 HXK同工酶活性染色
        2.2.7 OsHXK6基因克隆与重组表达质粒构建
        2.2.8 OsHXK6原核表达
        2.2.9 OsHXK6真核表达
第三章 实验结果
    3.1 OsHXK5和OsHXK6参与铵同化调节
        3.1.1 α-酮戊二酸调节水稻根部铵同化
        3.1.2 α-酮戊二酸调节己糖激酶同工酶活性
    3.2 OsHXK6基因克隆与序列分析
        3.2.1 水稻根总RNA提取和总cDNA第一链合成
        3.2.2 OsHXK6基因PCR扩增
        3.2.3 OsHXK6基因序列分析
    3.3 重组蛋白OsHXK6-27AA原核表达
        3.3.1 重组表达质粒pET-HXK6-27AA构建
        3.3.2 重组蛋白OsHXK6-27AA原核表达SDS-PAGE分析
    3.4 原核表达重组蛋白OsHXK6-27AA催化特性
        3.4.1 重组蛋白OsHXK6-27AA最适反应条件
        3.4.2 重组蛋白OsHXK6-27AA催化活性和抑制剂分析
        3.4.3 重组蛋白OsHXK6-27AA热稳定性和金属离子对酶活性影响
    3.5 重组蛋白OsHXK6-27AA真核表达
        3.5.1 OsHXK6-27AA酵母重组表达质粒构建
        3.5.2 OsHXK6-27AA酵母阳性重组子筛选
        3.5.3 重组蛋白OsHXK6-27AA真核表达SDS-PAGE分析
    3.6 酵母表达重组蛋白OsHXK6-27AA催化活性和抑制剂分析
第四章 讨论
参考文献
硕士期间发表/待发表论文
衷也感谢下基金资助
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]玉米黑粉菌CYP51稀有密码子和mRNA二级结构分析及与杀菌剂戊唑醇分子对接[J]. 李书祥,韩睿,袁利玲,熊丽,袁永泽,杨江科,闫云君,刘德立.  生物化学与生物物理进展. 2011(08)
[2]渗透胁迫下不同抗旱性小麦幼苗氨同化差异[J]. 张慧娜,王志强,崔国金,林同保.  应用生态学报. 2009(10)
[3]Mx基因稀有密码子和mRNA结构及大肠杆菌表达优化[J]. 尹春光,杜立新,赵桂平,李宏滨.  遗传. 2009(01)
[4]大肠杆菌表达系统的研究进展[J]. 戎晶晶,刁振宇,周国华.  药物生物技术. 2005(06)
[5]酶稳定性的研究进展[J]. 徐金库,张媛媛,刘均洪.  化学与生物工程. 2004(03)
[6]NaCl对水稻谷氨酸合酶和谷氨酸脱氢酶的胁迫作用[J]. 林清华,李常健,彭进,张楚富,Peng Shaobing,Bennett John.  武汉植物学研究. 2000(03)



本文编号：3603351