棉花逆境响应相关NAC类转录因子的克隆与分析

发布时间：2017-05-13 05:11

  本文关键词：棉花逆境响应相关NAC类转录因子的克隆与分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：干旱、盐、病害等逆境胁迫严重影响着植物正常的生长发育,进而制约着作物产量。植物在漫长的进化过程中,通过感知逆境信号,调控抵御逆境的相关基因表达变化,形成了诸多在逆境胁迫下的保护机制。NAC转录因子为植物所特有,目前对拟南芥、水稻等植物NAC基因的研究表明,NAC基因在植物生长发育,器官形成,植株衰老,激素信号传导及逆境胁迫应答中发挥着重要作用。目的:在亚洲棉全基因组中预测分析NAC基因,进一步开发棉花NAC基因资源;克隆获得陆地棉NAC转录因子,研究其在干旱、盐、病害等逆境胁迫下的表达,分析其转录活性,为揭示棉花NAC转录因子在响应逆境胁迫中的作用奠定基础方法:利用生物信息学方法预测亚洲棉全基因组的NAC基因;采用RT-PCR方法克隆Gh SNAC5和Gh SNAC8基因;采用实时荧光定量PCR技术分析基因在干旱、盐、病害等逆境胁迫下的表达;通过构建酵母转录激活载体和亚细胞定位载体分析基因的转录因子活性;采用基因工程方法构建Gh SNAC5和Gh SNAC8基因的植物表达载体;通过农杆菌介导法转化烟草。结果:在亚洲棉全基因组中预测了138个NAC基因,根据Ga NAC蛋白的序列相似性及系统进化分析,将其分为11个亚家族,每个亚家族的Ga NAC蛋白数目为4-25个。基因结构分析发现,63.7%的Ga NAC基因含有2个内含子。Gh SNAC5基因的c DNA序列长度为1080bp,其开放阅读框(ORF)编码299个氨基酸。Gh SNAC8基因的c DNA序列长度为1104bp,其开放阅读框(ORF)编码349个氨基酸。2个基因所编码的蛋白序列在N-末端均含有NAM保守域。对基因结构分析发现Gh SNAC5和Gh SNAC8基因分别各含有3个外显子2个内含子,且内含子具有典型的植物内含子特征。利用荧光实时定量PCR分析了Gh SNAC5和Gh SNAC8基因受高盐、干旱及黄萎病胁迫处理后的表达变化。结果显示,Gh SNAC5和Gh SNAC8基因在受到干旱处理2h后,表达明显上调,24h后呈现下降态势;Gh SNAC5和Gh SNAC8基因在受到高盐处理2h后,表达量明显上调。Gh SNAC5基因在高盐胁迫12h后,相对表达量上调了50倍,这说明Gh SNAC5基因在响应盐胁迫时,具有高表达性。Gh SNAC5和Gh SNAC8基因在受到黄萎病VD8处理6h后,相对表达量明显上升,比受干旱及盐处理的响应时间要延后。通过构建酵母转录激活载体对Gh SNAC5和Gh SNAC8基因的转录激活活性进行了试验,缺失培养生长情况及β-gal显色结果显示,Gh SNAC5和Gh SNAC8基因均能转录激活下游基因的表达。利用p BI221-GFP载体将Gh SNAC5和Gh SNAC8与GFP构建融合蛋白,瞬时表达试验结果显示,Gh SNAC5和Gh SNAC8均定位与细胞核内。利用p CAMBIA3301及p ROKⅡ构建了一个新载体,与Gh SNAC5和Gh SNAC8基因重组构建了植物过表达载体,并成功转化至烟草。结论:通过比较亚洲棉与陆地棉、雷蒙德氏棉NAC蛋白的同源性,发现亚洲棉与雷蒙德氏棉NAC蛋白的匹配程度高于陆地棉,为亚洲棉及陆地棉NAC转录因子的后续深入研究提供了重要参考。本研究从陆地棉中克隆并分析了两个NAC基因Gh SNAC5和Gh SNAC8,为Gh SNAC5和Gh SNAC8基因功能的深入研究奠定基础,并为棉花的遗传改良提供了基因资源;
【关键词】：棉花 NAC转录因子 克隆 表达 逆境胁迫
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S562;Q943.2
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-9
• 符号说明9-10
• 第一章 文献综述10-17
• 1.1 NAC转录因子的研究进展10-14
• 1.1.1 NAC转录因子的发现10-11
• 1.1.2 NAC转录因子的结构特点11
• 1.1.3 NAC转录因子的作用机制11-12
• 1.1.4 NAC基因的调控机制12
• 1.1.5 NAC转录因子的功能研究进展12-14
• 1.2 棉花NAC转录因子的研究进展14-15
• 1.2.1 雷蒙德氏棉和亚洲棉NAC转录因子研究14-15
• 1.2.2 陆地棉NAC转录因子研究15
• 1.3 研究意义15-17
• 第二章 亚洲棉全基因组NAC基因的预测及分析17-31
• 2.1 试验材料17
• 2.1.1 序列17
• 2.1.2 主要生物软件及网站17
• 2.2 试验方法17-18
• 2.2.1 亚洲棉NAC基因的鉴定17-18
• 2.2.2 亚洲棉NAC基因系统进化树的构建18
• 2.2.3 miR164靶序列的预测18
• 2.3 试验结果18-29
• 2.3.1 亚洲棉NAC基因的鉴定18-20
• 2.3.2 亚洲棉GaNAC基因结构的分析20-25
• 2.3.3 亚洲棉GaNAC蛋白的系统进化分析25-26
• 2.3.4 miR164靶基因的分析26-27
• 2.3.5 GhSNAC5和GhSNAC8基因与138个GaNACs及78个GhNACs的比对27-29
• 2.4 本章讨论29-31
• 第三章 棉花GhSNAC5和GhSNAC8基因的克隆及生物信息学分析31-40
• 3.1 试验材料31-32
• 3.1.1 植物材料与菌株31
• 3.1.2 酶与试剂盒31
• 3.1.3 培养基与试剂31-32
• 3.1.4 主要仪器设备32
• 3.1.5 引物序列32
• 3.2 试验方法32-36
• 3.2.1 RNA提取及反转录32-33
• 3.2.2 DNA提取33-34
• 3.2.3 目的基因的克隆34-35
• 3.2.4 GhSNAC5和GhSNAC8基因生物生物信息学分析35-36
• 3.3 试验结果36-38
• 3.3.1 GhSNAC5和GhSNAC8基因的获得36-37
• 3.3.2 GhSNAC5和GhSNAC8基因的生物信息学分析37-38
• 3.4 本章讨论38-40
• 第四章 GhSNAC5和GhSNAC8基因的转录因子性质分析40-53
• 4.1 试验材料40-42
• 4.1.1 菌株和质粒载体40
• 4.1.2 酶及试验药品40
• 4.1.3 培养基40-41
• 4.1.4 常用试剂41
• 4.1.5 引物序列41-42
• 4.2 试验方法42-47
• 4.2.1 GhSNAC5和GhSNAC8转录激活试验42-44
• 4.2.2 GhSNAC5和GhSNAC8基因亚细胞定位44-47
• 4.3 试验结果47-52
• 4.3.1 GhSNAC5和GhSNAC8基因转录激活活性分析47-50
• 4.3.2 GhSNAC5和GhSNAC8基因亚细胞定位试验50-52
• 4.4 本章讨论52-53
• 第五章 GhSNAC5和GhSNAC8基因的表达分析53-57
• 5.1 试验材料53
• 5.1.1 试验材料53
• 5.1.2 药品及试剂盒53
• 5.1.3 引物53
• 5.2 试验方法53-54
• 5.2.1 棉花处理53-54
• 5.2.2 RNA提取及反转录54
• 5.2.3 实时荧光定量PCR54
• 5.3 试验结果54-56
• 5.3.1 黄萎病VD8侵染棉花幼苗的表型变化54-55
• 5.3.2 GhSNAC5基因的表达量变化55
• 5.3.3 GhSNAC8基因的表达量变化55-56
• 5.4 本章讨论56-57
• 第六章 植物过表达载体的构建及烟草转化57-68
• 6.1 试验材料57-59
• 6.1.1 植物、菌株及载体57
• 6.1.2 培养基57-58
• 6.1.3 引物序列58-59
• 6.2 试验方法59-62
• 6.2.1 pCAMBIA3301及pROKⅡ构建成一个新载体pCAMBIA3301new59
• 6.2.2 植物过表达载体的构建59-60
• 6.2.3 重组植物过表达载体转化农杆菌60-61
• 6.2.4 叶盘法转化烟草61-62
• 6.2.5 转基因烟草的分子鉴定62
• 6.3 试验结果62-66
• 6.3.1 pCAMBIA3301及pROKⅡ构建成一个新载体62-63
• 6.3.2 植物过表达载体的构建63-65
• 6.3.3 叶盘法转化烟草65-66
• 6.3.4 转基因烟草的分子鉴定66
• 6.4 本章讨论66-68
• 第七章 结论及展望68-69
• 7.1 结论68
• 7.2 展望68-69
• 参考文献69-74
• 附录74-77
• 致谢77-78
• 作者简介78-79
• 附件79

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 邵凤霞;柳展基;魏丽奇;曹敏;毕玉平;;花生NAC类新基因AhNAC1的克隆及序列分析[J];西北植物学报;2008年10期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 卢敏;玉米ZmSNAC1和高粱SbSNAC1基因的克隆与功能分析[D];中国农业科学院;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 邵凤霞;花生NAC转录因子的克隆和功能分析[D];山东师范大学;2009年

2 赵凤利;棉花叶片衰老相关基因GhNAC12的功能分析[D];中国农业科学院;2014年

  本文关键词：棉花逆境响应相关NAC类转录因子的克隆与分析，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：361639