3株野鸟源H7亚型禽流感病毒分离鉴定、遗传进化及感染性分析

发布时间：2017-05-18 12:07

  本文关键词：3株野鸟源H7亚型禽流感病毒分离鉴定、遗传进化及感染性分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本研究在2010年1月份采自湖南小白额雁和青头潜鸭样品中分离到2株H7亚型禽流感病毒,分别命名为A/Lesser White-fronted Goose/HuNan/412/2010(H7N7)(L-412)和A/Baer's Pochard/HuNan/414/2010(H7N 1)(29Y);同年秋季在采自吉林向海地区的红头潜鸭样品中分离到1株H7亚型禽流感病毒,命名为A/Common Pochard/XiangHai/ 420/2010(H7N1)(865).通过RT-PCR试验和基因测序,成功获得了3株分离株的全基因序列。在此基础上,进一步对3株分离株进行了遗传进化、感染性和受体结合特性分析,具体实验结果如下：1.3株野鸟源H7亚型AIV毒株的分离鉴定、遗传进化分析3株分离株的8个基因都位于欧亚分支内,分离株L-412有6个基因来源于韩国野鸟分离株,NS基因与部分北美毒株、2003年荷兰H7N7亚型人流感毒株基因核苷酸同源性很高,为98.2%和97.7%。L-412是由亚洲不同毒株的片段重组而成,并且NS基因存在欧亚、北美分支以及跨物种之间的交流。分离株29Y和865的8个基因彼此之间高度同源,均来自于欧亚毒株,2株分离株的PB1基因与2013年意大利和2003年荷兰人流感毒株、2008年韩国猪流感毒株基因核苷酸同源性在97%以上,NP基因则与某些人流感、猪流感、北美毒株属于同一分支,NS基因与某些北美毒株、2003年荷兰H7N7亚型人流感毒株基因核苷酸同源性很高,为98.2%和97.7%。通过多氨基酸序列比对分析发现,3株分离株的NS基因42位突变为S,推断此3株分离株对小鼠有较高的毒力。2.HA蛋白裂解位点附近氨基酸分析3株分离株的HA蛋白裂解位点附近氨基酸序列分别为PEIPKGR↓GLFGAI、PELPKGR↓GLFGAI和PELPKGR↓GLFGAI,符合低致病性禽流感病毒的序列特征。3.L-412对不同动物的感染性分析L-412以106EID50的剂量以滴鼻、点眼的方式感染SPF鸡、SPF鸭,观察21d。鸡、鸭感染后均以泄殖腔排毒为主,能在多个脏器内检测到；在第14d检测到抗体。说明该毒株在鸡、鸭体内皆可复制,但是只在鸡个体之间水平传播。4.29Y对不同动物的感染性分析29Y以106EID50的剂量感染SPF鸡、SPF鸭和鼠,观察21d。鸡、鸭感染后在咽喉、泄殖腔内均检测不到病毒,仅能在个别脏器内检测到病毒,在第14d检测到抗体；攻毒组的鼠在肺脏内均可检测到病毒。说明该毒株既能够轻度感染鸡、鸭和鼠,并且在鸭个体之间发生水平传播。5.865对不同动物的感染性分析865以上述方法感染SPF鸡、SPF鸭和鼠。鸡、鸭感染后均可以在咽喉、泄殖腔和多个脏器内检测到病毒。在第14d检测到抗体。攻毒组的鼠在鼻洗液和肺脏内均可检测到病毒。说明该毒株既能够感染鸡、鸭也能感染鼠,并且在鸡／鸭个体之间均可发生水平传播。6.3株H7亚型AIV毒株的受体结合特性的分析利用a-2,3-sialidase和VCNA处理鸡红细胞。根据血凝试验结果,我们发现3株分离株既能结合SAa-2,3Ga1受体,又能结合SAa-2,6Ga1受体。说明3株分离株既能够感染禽类,还能感染哺乳动物。
【关键词】：野鸟 H7亚型流感病毒 全基因组测序 系统发育学分析 致病性试验
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 1 绪论12-21
• 1.1 禽流感病毒的研究进展12-17
• 1.1.1 AIV的发现及其发展历史12-13
• 1.1.2 AIV的分类地位及其命名13
• 1.1.3 AIV的化学组成及对理化因素的抵抗力13-14
• 1.1.4 AIV的增殖14
• 1.1.5 AIV的病毒基因组及其编码的蛋白14-15
• 1.1.6 AIV的血凝活性15
• 1.1.7 AIV的流行病学研究15-17
• 1.2 H7亚型AIV的流行现状17
• 1.3 H7亚型流感病毒的某些生物学特性17-18
• 1.4 禽流感病毒致病性的分子基础18-20
• 1.4.1 血凝素(HA)基因对致病性的影响18
• 1.4.2 神经氨酸酶(NA)基因对致病性的影响18
• 1.4.3 聚合酶(PB2、PB1、PA)基因对致病性的影响18-19
• 1.4.4 非结构蛋白(NS)基因对致病性的影响19
• 1.4.5 基质蛋白(M)基因对致病性的影响19-20
• 1.5 本课题研究的目的和意义20-21
• 2 3株野鸟源H7亚型AIV毒株的分离鉴定、遗传进化分析21-55
• 2.1 实验材料21
• 2.1.1 样品来源21
• 2.1.2 实验试剂及配方21
• 2.1.3 实验仪器21
• 2.1.4 鸡胚及红细胞21
• 2.2 实验方法21-26
• 2.2.1 拭子采集和处理21-22
• 2.2.2 病毒的分离22
• 2.2.3 红细胞凝集试验(HA)22
• 2.2.4 AIV的RT-PCR检测22-23
• 2.2.5 PCR结果鉴定23
• 2.2.6 血凝素(HA)亚型的鉴定23-25
• 2.2.7 AIV神经氨酸酶(NA)亚型的鉴定25
• 2.2.8 病毒全基因组基因扩增与测序25-26
• 2.3 实验结果与分析26-47
• 2.3.1 病毒分离鉴定结果26
• 2.3.2 HA亚型的鉴定26
• 2.3.3 NA亚型的鉴定26-27
• 2.3.4 病毒全基因的扩增和测序27-28
• 2.3.5 基因遗传进化分析28-37
• 2.3.6 基因同源性分析结果37-46
• 2.3.7 血凝素蛋白裂解位点46
• 2.3.8 糖基化位点分析46-47
• 2.3.9 受体结合位点47
• 2.4 讨论47-54
• 2.4.1 H7基因的分子遗传分析47-49
• 2.4.2 N1基因的分子遗传分析49-50
• 2.4.3 N7基因的分子遗传分析50
• 2.4.4 PB2基因的分子遗传分析50-51
• 2.4.5 PB1基因的分子遗传分析51
• 2.4.6 PA基因的分子遗传分析51-52
• 2.4.7 NP基因的分子遗传分析52
• 2.4.8 M基因的分子遗传分析52-53
• 2.4.9 NS基因的分子遗传分析53-54
• 2.5 小结54-55
• 3 L-412对不同动物的感染性分析55-62
• 3.1 材料55
• 3.1.1 毒株55
• 3.1.2 实验动物55
• 3.1.3 实验仪器55
• 3.2 方法55-56
• 3.2.1 病毒的纯化与保存55
• 3.2.2 鸡胚半数感染量(EID_(50))的测定55
• 3.2.3 SPF鸡、鸭感染性试验55-56
• 3.2.4 鸡、鸭脏器和拭子的滴定56
• 3.2.5 血凝抑制试验(HI)56
• 3.3 结果56-60
• 3.3.1 鸡胚半数感染量(EID_(50))结果56-57
• 3.3.2 SPF鸡感染性试验57-58
• 3.3.3 SPF鸭感染性试验58-59
• 3.3.4 两组实验的对比结果59-60
• 3.4 讨论60-61
• 3.4.1 两组实验结果对比60-61
• 3.5 小结61-62
• 4 29Y对不同动物的感染性分析62-68
• 4.1 材料62
• 4.1.1 毒株62
• 4.1.2 实验动物62
• 4.1.3 实验仪器62
• 4.2 方法62
• 4.2.1 病毒的纯化与保存62
• 4.2.2 鸡胚半数感染量(EID_(50))的测定62
• 4.2.3 SPF鸡/鸭和鼠感染性试验62
• 4.2.4 鸡/鸭/鼠脏器和拭子的滴定62
• 4.2.5 血凝抑制试验(HI)62
• 4.3 结果62-67
• 4.3.1 鸡胚半数感染量(EID_(50))结果62-63
• 4.3.2 SPF鸡感染性试验63-64
• 4.3.3 SPF鸭感染性试验64-65
• 4.3.4 SPF鼠感染性试验65
• 4.3.5 鸡/鸭/鼠脏器的病理切片结果65-67
• 4.4 讨论67
• 4.4.1 鸡/鸭/鼠感染性试验结果的对比67
• 4.5 小结67-68
• 5 865对不同动物的感染性分析68-76
• 5.1 材料68
• 5.1.1 毒株68
• 5.1.2 实验动物68
• 5.1.3 实验仪器68
• 5.2 方法68
• 5.2.1 病毒的纯化与保存68
• 5.2.2 鸡胚半数感染量(EID_(50))的测定68
• 5.2.3 SPF鸡/鸭和鼠感染性试验68
• 5.2.4 鸡/鸭/鼠脏器和拭子的滴定68
• 5.2.5 血凝抑制试验(HI)68
• 5.3 结果68-73
• 5.3.1 鸡胚半数感染量(EID_(50))结果68-69
• 5.3.2 SPF鸡感染性试验69-70
• 5.3.3 SPF鸭感染性试验70-71
• 5.3.4 SPF鼠感染性试验71
• 5.3.5 鸡/鸭/鼠脏器的病理切片结果71-73
• 5.4 29Y和865在鸡/鸭/鼠各脏器内复制情况73-74
• 5.5 讨论74-75
• 5.5.1 鸡/鸭/鼠感染性试验结果的对比74
• 5.5.2 29Y和865对鸡/鸭/鼠试验结果对比74-75
• 5.6 小结75-76
• 6 3株H7亚型AIV毒株的受体结合特性分析76-79
• 6.1 材料76
• 6.1.1 主要试剂76
• 6.1.2 毒株76
• 6.2 方法76-77
• 6.2.1 测定L-412,29Y和865的受体结合特性76-77
• 6.3 结果77-78
• 6.3.1 受体结合特性分析77-78
• 6.4 讨论78
• 6.5 小结78-79
• 结论79-80
• 参考文献80-88
• 附录88-98
• 攻读学位期间发表的学术论文98-99
• 致谢99-100

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 杨旭芹,梁光军,张小荣,文其乙,刘秀梵;H7亚型禽流感病毒血凝素基因的真核表达载体的构建及鉴定[J];中国家禽;2004年S1期

2 姚斐,沙莎,陈刚,纪伟尚,徐怀恕;间接酶联免疫吸附技术检测活的非可培养状态的大肠杆菌O157:H7[J];青岛海洋大学学报(自然科学版);2001年02期

3 李永红;;中国部分地区人群和动物中肠出血性大肠埃希菌O157∶H7分布特征[J];疾病监测;2008年07期

4 张建群;罗学辉;顾文珍;徐景野;;1株肠出血性大肠杆菌O157∶H7检测及菌株特征[J];浙江预防医学;2011年12期

5 徐建国;第三讲　O157 : H7 大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌[J];疾病监测;1997年06期

6 徐建国;第三讲 O157∶H7大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌[J];疾病监测;1997年07期

7 顾宝柯,王春宴,李生,谢梅雯;家畜、家禽肠出血性大肠杆菌O157∶H7的监测[J];疾病监测;2000年06期

8 龚云伟,王平,刘红,乔凤娟;肠出血性大肠杆菌O157∶H7监测及分析[J];微生物学杂志;2004年05期

9 宋宏新,程军表;肠出血性大肠杆菌O157∶H7特异性脂多糖抗原的制备[J];中华微生物学和免疫学杂志;2005年10期

10 徐义刚;崔丽春;李苏龙;于恒纯;李丹丹;谢晓峰;姜艳春;;肠出血性大肠埃希菌O157∶H7环介导恒温扩增快速检测方法的建立与应用[J];中国人兽共患病学报;2010年07期

中国重要会议论文全文数据库 前6条

1 夏兴霞;王永山;孟祥升;朱国强;张雪寒;何孔旺;;大肠杆菌O157:H7单克隆抗体胶体金免疫层析检测试纸条的研制[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次人兽共患病学术研讨会暨第六届第十四次教学专业委员会论文集[C];2012年

2 刘洁;夏兴霞;王永山;张雪寒;费荣梅;何孔旺;;大肠杆菌O157:H7抗体胶体金免疫层析检测试纸条的研制[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第二次学术研讨会论文集[C];2010年

3 刘洁;夏兴霞;王永山;张雪寒;费荣梅;何孔旺;;大肠杆菌O157:H7抗体胶体金免疫层析检测试纸条的研制[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病防控学术研讨会论文集[C];2010年

4 陈雅君;段志刚;魏战勇;王亚宾;崔保安;张龙现;陈丽颖;胡慧;;动物源大肠杆菌O157，

本文编号：376001