苹果乙烯响应因子ERF1B调控LOX途径香气合成的机理研究

发布时间：2023-04-22 08:44

　　果实香气对苹果的品质性状的影响是具有决定性的,果实良好的嗅感能够增加其商品价值,从而获得更大的商业价值。果实香气的合成过程相对复杂,其中研究较为广泛的是的脂氧合酶途径,脂氧合酶基因作为该途径的关键基因引起学者的重视,但具体的作用机理还不清楚。乙烯对果实的成熟进程具促进作用,被称为果实成熟激素。在多数植物体内,乙烯的响应因子ERFs位于乙烯响应途径的下游,将乙烯信号传递至下游基因,完成乙烯参与果实成熟的转导。不仅如此,乙烯通过PpERF1,PpERF2等调控LOX基因的表达来参与果实香气物质合成过程,但苹果中ERF家族具体参与香气合成的作用机理还不明确。另外,关于MADS蛋白的研究从未停止,尤其是在调控乙烯信号的转导、参与果实成熟以及香气合成等方面。因此,为深入探究上述基因家族的功能,本研究以‘长富2’作试材,通过定量进行基因筛选,克隆MdLOX1a、MdMADS24及MdERF1B基因,对基因功能展开研究,结果如下:1.在苹果盛花105d后每15d左右取样,测定香气物质的相对含量及乙烯释放速率;通过实时的荧光定量对LOX途径的结构基因,MADS及ERF家族基因表达筛选。结果表明,随着果...

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1 前言
    1.1 国内苹果产业发展现状及趋势
        1.1.1 国内苹果产业发展现状
        1.1.2 国内苹果产业的发展趋势
    1.2 果实香气物质研究进展
        1.2.1 果实香气合成途径
        1.2.2 香气合成的脂氧合酶途径关键基因
    1.3 MADS-box家族研究进展
        1.3.1 MADS-box家族的结构与分类
        1.3.2 MADS-box蛋白功能的研究
    1.4 ERF家族研究进展
        1.4.1 ERF基因结构与分类
        1.4.2 ERF基因功能的研究
    1.5 研究的内容与意义
        1.5.1 研究内容
        1.5.2 研究的意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株
        2.1.3 载体
        2.1.4 酶类、抗体、抗生素等试剂与药品
        2.1.5 引物
        2.1.6 培养基配方
    2.2 实验方法
        2.2.1 基因组DNA的提取
        2.2.2 总RNA的提取
        2.2.3 反转录反应
        2.2.4 荧光定量qRT-PCR
        2.2.5 基因的克隆
        2.2.6 PCR产物胶回收
        2.2.7 连接中间载体
        2.2.8 大肠杆菌感受态(DH5α)的转化
        2.2.9 菌落PCR验证与测序
        2.2.10 质粒的提取
        2.2.11 载体和质粒双酶切
        2.2.12 连接表达载体载体
        2.2.13 表达载体构建
        2.2.14 农杆菌感受态的转化
        2.2.15 苹果‘王林’愈伤组织的转基因实验
        2.2.16 酵母双/单杂实验
        2.2.17 双分子荧光素互补实验
        2.2.18 蛋白实验涉及方法
        2.2.19 染色质免疫共沉淀(ChIP)实验
        2.2.20 目的质粒大提
        2.2.21 LUC实验
        2.2.22 果实香气挥发性成分相对含量测定
        2.2.23 果实乙烯释放速率测定
3 结果与分析
    3.1 ERF、MADS转录因子及LOX基因在苹果成熟过程的表达差异及筛选
        3.1.1 富士苹果乙烯释放速率及果实香气测定
        3.1.2 相关基因的筛选
    3.2 MdLOX1a与 MdMADS24 基因的进化树及生物信息学等相关分析
        3.2.1 MdLOX1a进化树及生物信息学分析
        3.2.2 MdMADS24 进化树及生物信息学分析
    3.3 MdLOX1a基因的亚细胞定位及功能验证
        3.3.1 MdLOX1a基因的亚细胞定位
        3.3.2 MdLOX1a基因的功能验证
        3.3.3 MdLOX1a启动子克隆及元件分析
    3.4 MdMADS24 基因克隆及功能的鉴定
        3.4.1 MdMADS24 促进香气物质合成
        3.4.2 MdMADS24 可与下游香气物质合成结构基因启动子结合
    3.5 MdERF1B基因的克隆和功能鉴定及挖掘
        3.5.1 MdERF1B共转OEMADS24 的试材
        3.5.2 MdERF1B与 MdMADS24 互作形成异源蛋白复合物促进香气物质合成
        3.5.3 LUC实验检测MdERF1B与MdMADS24 复合物对下游基因启动子影响
4 讨论
    4.1 MdLOX1a基因促进香气挥发性物质的合成
    4.2 MdMADS24 促进MdLOX1a转录调控香气物质的合成
    4.3 MdERF1B与 MdMADS24 蛋白间互作联合促进香气物质的合成
5 结论
6 参考文献
7 附录
8 致谢
9 攻读学位期间发表的学术论文



本文编号：3797307