SPACA3与SPACA1、PDIA3及CRISP2之间的相互作用鉴定

发布时间：2023-04-28 16:56

　　受精是哺乳动物有性生殖的基本过程,精卵融合是受精过程的关键步骤,它是由多个分子共同参与并协助完成的过程。研究发现,哺乳动物的精卵融合除了必需有精子的IZUMO1与卵子的JUNO相互作用外,还需要PDIA3、CRISP2、SPACA3以及SPACA1等多种其他精子或卵子上的蛋白相互作用。本研究用酵母双杂交和免疫共沉淀技术在分子水平上鉴定了大鼠SPACA1与SPACA3之间的相互作用。并利用间接免疫荧光技术对SPACA1与SPACA3、PDIA3与SPACA3、PDIA3与CRISP2在大鼠和绵羊精子上进行共定位。为全面理解精卵融合的分子机制提供了新的资料。首先,我们克隆了大鼠spaca1和spaca3的cDNA及绵羊pdia3、crisp2和spaca3的cDNA,构建pGBK-spaca1与pGAD-spaca3酵母表达载体和pCMV-C-HA-spaca1与pCMV-C-Flag-spaca3真核表达载体,分别用酵母双杂交和免疫共沉淀的实验方法鉴定发现SPACA1与SPACA3之间存在相互作用。鉴定蛋白的细胞和亚细胞定位需要抗体。为了制备大鼠SPACA1和SPACA3以及绵羊PDIA...

【文章页数】：105 页

【学位级别】：硕士

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摘要
abstract
符号说明
第一章 文献综述
    1.1 精子的成熟
    1.2 精子获能
    1.3 顶体反应与膜融合
    1.4 精卵融合相关蛋白
        1.4.1 精子顶体相关(Sperm acrosome associated,SPACA)蛋白家族
            1.4.1.1 精子顶体相关蛋白 3(Sperm acrosome associated 3,SPACA3)
            1.4.1.2 精子顶体相关蛋白1(Sperm acrosome associated 1,SPACA1)
        1.4.2 蛋白二硫异构酶A家族成员PDIA3
        1.4.3 富含半胱氨酸的分泌蛋白家族成员CRISP2
        1.4.4 免疫球蛋白超家族成员IZUMO1
    1.5 与精卵融合相关蛋白(SPACA1/SPACA3/PDIA3/CRISP2/IZUMO1)相互作用的蛋白
    1.6 小结
第二章 SPACA1和SPACA3 的相互作用鉴定
    引言
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验仪器设备
        2.1.2 实验试剂
        2.1.3 实验动物及实验菌种
        2.1.4 实验细胞及载体
        2.1.5 实验常用溶液的配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 大鼠睾丸组织总RNA的提取
        2.2.2 大鼠睾丸组织cDNA的合成
        2.2.3 大鼠睾丸组织cDNA的检测
        2.2.4 大鼠spaca1和spaca3 CDS区全长的克隆
            2.2.4.1 大鼠spaca1与spaca3 CDS全长克隆引物的设计与合成
            2.2.4.2 大鼠spaca1与spaca3 CDS区全长克隆
            2.2.4.3 大鼠pMD19-T-spaca1与pMD19-T-spaca3 重组载体的构建
        2.2.5 酵母双杂交实验
            2.2.5.1 大鼠spaca1与spaca3 亚克隆(酵母)引物的设计与合成
            2.2.5.2 大鼠spaca1与spaca3 过渡载体的构建
            2.2.5.3 大鼠spaca1与spaca3 酵母表达载体的构建
            2.2.5.4 LiAc法制备酵母感受态
            2.2.5.5 pGAD-spaca3与pGBK-spaca1 重组质粒转化酵母感受态细胞
            2.2.5.6 酵母双杂交
        2.2.6 免疫共沉淀验实验
            2.2.6.1 大鼠spaca1与spaca3 的亚克隆(真核)与真核表达载体的构建
                2.2.6.1.1 大鼠spaca1与spaca3 的亚克隆(真核)引物的设计
                2.2.6.1.2 大鼠spaca1与spaca3 过渡载体的构建
                2.2.6.1.3 大鼠spaca1与spaca3 真核表达载体的构建
            2.2.6.2 293 细胞的培养
                2.2.6.2.1 细胞复苏
                2.2.6.2.2 细胞传代
                2.2.6.2.3 细胞铺板与转染
            2.2.6.3 磁珠法免疫沉淀目标蛋白
                2.2.6.3.1 Western-Blot检测免疫共沉淀结果
        2.2.7 SPACA1与SPACA3 多克隆抗体的制备
            2.2.7.1 大鼠spaca1与spaca3 原核表达载体的构建
                2.2.7.1.1 大鼠p MD19-T-spaca1与pMD19-T-spaca3 过渡载体的构建
                2.2.7.1.2 大鼠pET-28a-spaca1与pET-28a-spaca3 原核表达载体的构建
            2.2.7.2 大鼠SPACA1-HIS与 SPACA3-HIS融合蛋白表达
            2.2.7.3 大鼠SPACA1-HIS和 SPACA3-HIS融合蛋白SDS-PAGE鉴定
            2.2.7.4 大鼠SPACA1-HIS和 SPACA3-HIS蛋白Western-Blot鉴定
            2.2.7.5 大鼠SPACA1-HIS和 SPACA3-HIS融合蛋白切胶纯化
            2.2.7.6 大鼠SPACA1-HIS和 SPACA3-HIS蛋白浓度测定
            2.2.7.7 SPACA3与SPACA1 多克隆抗体的制备及鉴定
                2.2.7.7.1 SPACA1-HIS与 SPACA3-HIS免疫实验动物
                2.2.7.7.2 S180腹水瘤细胞的培养
                2.2.7.7.3 SPACA1与SPACA3 多克隆抗体的特异性识别检测
        2.2.8 SPACA1与SPACA3 在大鼠睾丸组织中的定位
        2.2.9 SPACA1与SPACA3 在大鼠精子顶体反应前后的定位
    2.3 结果
        2.3.1 大鼠睾丸组织cDNA检测
        2.3.2 大鼠spaca1与spaca3 酵母表达载体的构建
            2.3.2.1 大鼠spaca1与spaca3 CDS区全长的克隆
            2.3.2.2 pMD19-T-spaca1与p MD19-T-spaca3 的双酶切鉴定
            2.3.2.3 pGBK-spaca1与pGAD-spaca3 酵母表达载体的构建
        2.3.3 酵母双杂交实验
            2.3.3.1 pGBK-spaca1与pGAD-spaca3 转化酵母感受态菌落PCR鉴定
            2.3.3.2 酵母双杂交
        2.3.4 免疫共沉淀实验
            2.3.4.1 大鼠spaca3与spaca1 真核表达载体的构建
            2.3.4.2 免疫共沉淀
        2.3.5 大鼠SPACA3与SPACA1 抗体的制备
            2.3.5.1 大鼠pET-28a-spaca3与pET-28a-spaca1 原核表达载体的构建
            2.3.5.2 大鼠SPACA3-HIS与 SPACA1-HIS原核蛋白的表达以及鉴定
            2.3.5.3 大鼠SPACA3-HIS与 SPACA1-HIS原核蛋白的纯化以及鉴定
            2.3.5.4 大鼠SPACA3-HIS与 SPACA1-HIS融合蛋白的浓度测定
            2.3.5.5 SPACA3与SPACA1 多克隆抗体的制备及检测
        2.3.6 SPACA3与SPACA1 在大鼠睾丸组织中的定位
        2.3.7 SPACA3与SPACA1 在大鼠精子上的共定位
        2.3.8 利用Image J软件分析SPACA3与SPACA1 的共定位结果
    2.4 讨论
        2.4.1 SPACA1与SPACA3 在生殖组织和生殖细胞中的定位分析
        2.4.2 SPACA1与SPACA3 相互作用的分析
    2.5 本章小结和创新点
        2.5.1 小结
        2.5.2 创新点
第三章 PDIA3、CRISP2和SPACA3 在绵羊精子上的共定位
    3.1 引言
    3.2 实验材料与方法
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 实验方法
            3.2.2.1 绵羊睾丸组织总RNA的提取及c DNA的合成与检测
            3.2.2.2 绵羊pdia3、crisp2和spaca3克隆载体的构建
                3.2.2.2.1 绵羊pdia3、crisp2和spaca3克隆引物的设计
                3.2.2.2.2 绵羊pdia3、crisp2和spaca3 CDS区全长的克隆
                3.2.2.2.3 绵羊p MD19-T-pdia3、pMD19-T-crisp2和p MD19-T-spaca3 克隆载体的构建
            3.2.2.3 绵羊PDIA3、CRISP2和SPACA3 多克隆抗体的制备
                3.2.2.3.1 绵羊pGEX-pdia3、pGEX-crisp2和pGEX-spaca3 原核表达载体的构建
                    3.2.2.3.1.1 绵羊pdia3、crisp2和spaca3 过渡载体的构建
                    3.2.2.3.1.2 pGEX-pdia3、pGEX-crisp2和pGEX-spaca3 原核表达载体的构建
                3.2.2.3.2 绵羊PDIA3-GST、CRISP2-GST和 SPACA3-GST融合蛋白的表达与鉴定
                3.2.2.3.3 绵羊PDIA3-GST、CRISP2-GST和 SPACA3-GST融合蛋白的鉴定
                3.2.2.3.4 绵羊PDIA3-GST、CRISP2-GST和 SPACA3-GST融合蛋白的纯化及鉴定
                3.2.2.3.5 纯化后的PDIA3-GST、CRISP2-GST和 SPACA3-GST免疫实验动物
            3.2.2.4 PDIA3-GST、CRISP2-GST和 SPACA3-GST多克隆抗体的检测和纯化
            3.2.2.5 PDIA3、CRISP2和SPACA3 在绵羊精子顶体反应前后的共定位
    3.3 实验结果
        3.3.1 绵羊睾丸组织cDNA检测结果
        3.3.2 绵羊pdia3、crisp2和spaca3 克隆载体的构建
            3.3.2.1 绵羊pdia3、crisp2和spaca3 CDS区全长的克隆
            3.3.2.2 绵羊pMD19-T-pdia3、p MD19-T-crisp2和pMD19-T-spaca3 的构建
        3.3.3 绵羊PDIA3、CRISP2和SPACA3 血清及腹水多克隆抗体的制备
            3.3.3.1 绵羊pGEX-pdia3、pGEX-crisp2和pGEX-spaca3 原核表达载体的构建
            3.3.3.2 PDIA3-GST/CRISP2-GST/SPACA3-GST融合蛋白的表达与鉴定
            3.3.3.3 PDIA3-GST/CRISP2-GST/SPACA3-GST融合蛋白的纯化及鉴定
            3.3.3.4 PDIA3-GST/CRISP2-GST/SPACA3-GST多克隆抗体的检测与纯化
        3.3.4 PDIA3、CRISP2以及SPACA3 在绵羊精子顶体反应前后的定位
        3.3.5 利用Image J软件分析PDIA3、CRISP2和SPACA3 在绵羊精子上的共定位结果
    3.4 讨论
        3.4.1 PDIA3与CRISP2 共定位分析
        3.4.2 PDIA3与SPACA3 共定位分析
    3.5 本章小结和创新点
        3.5.1 小结
        3.5.2 创新点
参考文献
致谢
攻读硕士期间参与的科研项目和发表论文



本文编号：3804098