Sly-miR319b调控TCPs响应番茄低钾胁迫的分子机制

发布时间：2023-04-30 06:13

　　番茄作为重要的蔬菜作物,易受到环境(低温、光照、土壤pH值以及土壤本身钾含量低)及本身发育时期(发育中后期)等影响,在生长发育过程中出现缺钾症状而影响番茄的品质与产量。课题组前期通过小RNA的测序发现在耐低钾型番茄品系JZ34和钾敏感型品系JZ18中miR319b表达水平呈现极差异显著。miRNA作为生物体内源性非编码的小分子RNA,通过特异识别靶mRNA对其发生切割或抑制,进而在转录水平上负调控基因表达。已有研究表明miR319可以靶向TCP转录因子调控植物的生长发育。本课题组经前期转录组数据研究发现miR319在植物响应低钾胁迫。基于此,本研究一方面以RLM-5’RACE鉴定SlmiR319b靶基因断裂位点,进而使用酵母单杂交及EMSA方法确立SlmiR319b调控的靶基因SlTCP10介导的响应低钾胁迫的分子路径;另一方面构建miR319b过表达番茄转基因材料,测定了低钾条件下转基因株系根系形态、钾离子含量、ROS含量及茉莉酸含量。以上研究结果为深入解析miRNA应答低钾胁迫的信号转导途径及番茄的抗逆栽培和品质提升提供理论指导。主要研究结果如下:1.明确了植物中miR319家族成...

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摘要
Abstract
1 前言
    1.1 miRNA的发现和功能
        1.1.1 miRNA的发现
        1.1.2 miRNA的产生及作用机制
        1.1.3 miRNA及靶基因的研究方法
    1.2 植物miR319 的简介
        1.2.1 植物miR319 的发现
        1.2.2 miR319 参与调控叶片发育
        1.2.3 miR319 参与花发育调控
        1.2.4 miR319 响应非生物胁迫的研究
        1.2.5 miR319 响应生物胁迫的研究
    1.3 植物响应低钾胁迫的研究进展
        1.3.1 植物中钾的含量和功能
        1.3.2 低钾胁迫对植物生长发育的影响
        1.3.3 植物对低钾胁迫的响应
    1.4 本研究的目的与意义
2 材料与方法
    2.1 试验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 载体与菌株
        2.1.3 试剂
        2.1.4 植物组织培养培养基
        2.1.5 营养液配方
    2.2 实验方法
        2.2.1 启动子分析
        2.2.2 DNA提取
        2.2.3 质粒提取
        2.2.4 总RNA提取及mRNA纯化
        2.2.5 c DNA第一链的合成
        2.2.6 RLM-5’RACE扩增
        2.2.7 c DNA合成
        2.2.8 miRNA茎环法反转录
        2.2.9 实时定量PCR分析
        2.2.10 载体构建
        2.2.11 酵母感受态制备及转化
        2.2.12 转化农杆菌
        2.2.13 凝胶迁移试验(EMSA)
        2.2.14 遗传转化(叶盘法)
        2.2.15 番茄低钾胁迫处理
        2.2.16 根系观察和分析
        2.2.17 钾离子含量测定
        2.2.18 ROS含量测定
        2.2.19 茉莉酸含量测定
3 结果与分析
    3.1 植物miR319 家族成员分布与进化分析
    3.2 SlmiRNA319b靶基因筛选及作用位点的鉴定
        3.2.1 SlmiRNA319b靶基因筛选
        3.2.2 RLM-5'RACE扩增5'末端产物分析
        3.2.3 SlmiR319b切割位点序列分析
    3.3 TCP10与JA2 启动子结合实验验证
        3.3.1 酵母单杂检测TCP10与JA2 启动子的结合
        3.3.2 凝胶迁移试验检测TCP10与JA2 启动子的结合
    3.4 过表达SlmiRNA319b转基因植株的获得
        3.4.1 构建过表达miR319b表达载体
        3.4.2 过表达miR319b番茄遗传转化体系的建立
        3.4.3 过表达miR319b基因番茄转基因阳性植株的鉴定
        3.4.4 过表达miR319b番茄转基因阳性植株表达量分析
    3.5 过表达miR319b降低番茄的耐低钾性
        3.5.1 过表达miR319b番茄转基因株系低钾胁迫处理根系表型观察
        3.5.2 过表达miR319b番茄转基因株系低钾胁迫处理钾离子浓度分析
        3.5.3 过表达miR319b番茄转基因株系低钾胁迫ROS含量分析
        3.5.4 过表达miR319b番茄转基因株系T1 代茉莉酸含量分析
4 讨论
5 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 展望
参考文献
附录
致谢



本文编号：3806592