孵化温度对鸭胚基因组甲基化的时空影响及相关基因的转录调控研究

发布时间：2017-05-21 20:27

  本文关键词：孵化温度对鸭胚基因组甲基化的时空影响及相关基因的转录调控研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：孵化温度作为禽类胚胎发育的重要外源环境因素之一,适当改变能影响禽类胚胎及出壳后骨骼肌发育。我们猜测基因组表观遗传机制在其中起了重要作用,即孵化温度改变可能影响鸭胚基因组甲基化程度,进而影响基因表达水平,并最终导致鸭个体表型性状的改变。因此,本研究拟扩增鸭DNA甲基转移酶(DNMTS)和甲基结合蛋白(MBPS)基因家族基因cDNA部分序列,设计特异性荧光定量引物,研究孵化温度对甲基化相关基因表达的时空影响；在此基础上,从骨骼肌发育相关基因中筛选部分表达水平受孵化温度影响明显的基因,分析其启动子甲基化状态及表观修饰对基因转录调控的可能影响,从表观遗传角度探讨孵化温度影响禽类胚胎发育及成年表型的可能机制。主要研究结果如下：(1)克隆获得鸭DNMT1.DNMT3A,DNAMT3B,MBD3和MBD5基因cDNA部分序列,长度分别为507、481、443、387和525bp,与Genebank中原鸡的相应序列同源性达到91%～99%。(2)鸭胚腿肌、胸肌、心脏、肝脏和脾脏中均检测到DNMMT1.DNMT3A,DNMMT3B,MBD3和MBD5基因不同程度的表达,结果表明DNA甲基化参与组织形成,尤其在胸肌中高度表达,说明DNA甲基化可能在胸肌形成过程中具有特殊的意义。此外,检测到甲基化相关基因在脾脏中表达较高,表明DNA甲基化水平在细胞分裂旺盛的组织中相对较高。(3)孵化前期温度处理对DNMT1,DNMT3A和DNMT3B基因表达有显著影响(P0.05),说明DNA甲基化水平在胚胎发育前期呈明显变化趋势；在整个孵化期内,MBD3和MBD5在处理组和对照组中基因的表达模式一致,表明孵化温度对甲基结合蛋白基因家族成员转录水平的影响一致。(4)孵化前期的温度处理可显著上调骨骼肌发育相关基因Pax3,Pax7,sixl, Akirin2,MyoD,MyoG,Mfy5,MCK和TNNCl的表达(P0.05),而随着孵化时间的延长,温度处理则显著抑制Pax7,Six1,Akirin2,MyoD,MyoG和TNNCl基因的表达(P0.05),说明孵化温度对骨骼肌发育相关基因表达调控的影响具有明显阶段性。(5)孵化前期和中期,处理组内TNNCl基因启动子CpG岛甲基化水平显著低于对照组(P0.05)；孵化前期,处理组内Akirin2基因启动子CpG岛甲基化水平显著低于对照组(P0.05),说明孵化前期温度升高1℃,对基因启动子CpG岛的整体甲基化水平有抑制,但对基因表达水平有促进作用。
【关键词】：鸭 孵化温度 DNA甲基化 骨骼肌发育 胚胎阶段
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S834
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 常用词语英文缩写9-12
• 前言12
• 1 文献综述12-21
• 1.1 表观遗传机制12-15
• 1.1.1 DNA甲基化12-14
• 1.1.2 组蛋白修饰14
• 1.1.3 非编码RNA调控14
• 1.1.4 染色质重塑14-15
• 1.1.5 X染色体失活15
• 1.2 各类环境因素的表观遗传效应15-18
• 1.2.1 温度的表观遗传效应15-16
• 1.2.2 营养供给的表观遗传效应16-17
• 1.2.3 重金属的表观遗传效应17-18
• 1.2.4 其它环境因素的表观遗传效应18
• 1.3 孵化温度对禽类胚胎发育的影响研究18-20
• 1.3.1 对禽类基因组DNA甲基化的影响18-19
• 1.3.2 对禽类胚胎骨骼肌发育的影响19-20
• 1.3.3 对禽类胚胎其它方面的影响20
• 1.3.4 对禽类胚胎发育影响的可能机制20
• 1.4 本研究的目的意义20-21
• 2 材料与方法21-38
• 2.1 实验材料21-23
• 2.1.1 实验样品21-22
• 2.1.2 药品和试剂22-23
• 2.2 实验方法23-38
• 2.2.1 引物设计及合成23-26
• 2.2.2 RNA的提取及质检26
• 2.2.3 反转录26-27
• 2.2.4 DNMTS和MBD3&5克隆及测序27-30
• 2.2.5 鸭Akirin2和TNNC1基因启动子扩增30-32
• 2.2.6 qRT-PCR32-34
• 2.2.7 ELISA34
• 2.2.8 Sequenom MassArray系统甲基化检测34-38
• 2.3 数据分析38
• 3 结果与分析38-50
• 3.1 鸭DNMTS和MBD3&5编码区部分序列克隆与分析38-41
• 3.1.1 RNA提取结果38-39
• 3.1.2 PCR扩增结果与序列同源性分析39-40
• 3.1.3 荧光定量引物RT-PCR及鉴定40-41
• 3.2 孵化温度对DNA甲基化相关基因表达及酶活的影响41-46
• 3.2.1 孵化温度对DNMTS和MBD3&5基因表达的影响41-43
• 3.2.2 孵化温度对DNMTS酶活的影响43-46
• 3.3 孵化温度对骨骼肌发育相关基因表达及启动子甲基化的影响46-50
• 3.3.1 孵化温度对骨骼肌发育相关基因表达的影响46-47
• 3.3.2 鸭TNNC1和Akirin2基因启动子扩增47-48
• 3.3.3 鸭TNNC1和Akirin2基因启动子转录结合位点分析48
• 3.3.4 鸭TNNC1和Akirin2基因启动子甲基化测序48-50
• 4 讨论50-54
• 4.1 孵化温度对鸭胚基因组甲基化影响存在组织差异性50-51
• 4.2 孵化温度对鸭胚基因组甲基化影响存在组织差异性51-53
• 4.3 孵化温度影响骨骼肌发育相关基因表达及可能的调控机制53-54
• 5 结论54-56
• 参考文献56-62
• 致谢62-63
• 攻读硕士研究生期间参与的科研项目和发表的论文63

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