番茄斑驳花叶病毒和猕猴桃溃疡病菌单克隆抗体的创制及其检测应用

发布时间：2024-01-19 18:33

　　病毒病和细菌性病害是目前危害作物的两大类重要病害。近年来,由番茄斑驳花叶病毒(Tomato mottle mosaic virus,ToMMV)引起的番茄斑驳花叶病在我国云南、海南和山东等省的茄科作物上发生流行、危害,造成了巨大的产量和经济损失。由丁香假单胞杆菌猕猴致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidae,Psa)引起的猕猴桃溃疡病在我国猕猴桃产区也造成了毁灭性的危害,严重影响我国的脱贫攻坚政策和乡村振兴计划。为了掌握这两种病害的流行规律和建立科学的防控策略,急需建立这两种病原物的快速高效检测方法。为此,本论文分别制备了抗番茄斑驳花叶病毒和猕猴桃溃疡病菌的单克隆抗体,并以制备的单抗为核心建立成能特异、灵敏地检测这两种病原物的血清学方法,从而为这两种病害的检测诊断和科学防控提供检测技术和试剂。具体研究结果如下:(1)用提纯的ToMMV病毒粒子为免疫原免疫BALB/c小鼠,经杂交瘤细胞技术获得了6株能分泌抗ToMMV单抗的杂交瘤细胞,即2D6、9C12、26A10、3A4、23A4和17B11。这些杂交瘤细胞分泌的单抗腹水的间接ELISA效价高达10

【文章页数】：79 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
致谢
摘要
abstract
缩略词表
第一章 文献综述
    1 番茄斑驳花叶病毒的研究进展
        1.1 寄主范围、侵染症状及传播方式
        1.2 分子生物学特性和病毒粒子形态
        1.3 ToMMV检测方法
            1.3.1 田间诊断
            1.3.2 电镜观察
            1.3.3 分子生物学检测方法
            1.3.4 血清学检测方法
        1.4 防治策略
    2 猕猴桃溃疡病菌的研究进展
        2.1 猕猴桃溃疡病国内外发生情况
        2.2 猕猴桃溃疡病病原菌
        2.3 寄主范围及症状表现
        2.4 检测方法
            2.4.1 田间症状观察
            2.4.2 病原菌的分离鉴定
            2.4.3 分子生物学方法
        2.5 防治策略
            2.5.1 消灭传染源
            2.5.2 切断传播途径
            2.5.3 加强田间管理和提高植物抗病能力
    3 单克隆抗体技术及其在植物病毒和细菌检测中的应用
        3.1 单克隆抗体的研究进展
        3.2 单克隆抗体技术基本原理和基本流程
        3.3 单克隆抗体在植物病毒检测中的应用
        3.4 单克隆抗体在植物细菌中的应用
    4 研究目的和意义
第二章 番茄斑驳花叶病毒单克隆抗体的创制及其检测应用
    1 材料与方法
        1.1 实验材料及试剂
        1.2 番茄斑驳花叶病毒的提纯
        1.3 单克隆抗体的制备
            1.3.1 免疫动物
            1.3.2 细胞融合
            1.3.3 杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及细胞克隆
            1.3.4 单克隆抗体腹水制备及纯化
            1.3.5 单克隆抗体的亚类鉴定
            1.3.6 单抗腹水效价测定
        1.4 ToMMV单克隆抗体的Western blot分析
            1.4.1 SDS-PAGE
            1.4.2 样品制备及电泳
            1.4.3 湿转法转膜
        1.5 检测ToMMV的 ACP-ELISA方法的建立及单抗特性分析
            1.5.1 ACP-ELISA方法的步骤
            1.5.2 检测ToMMV ACP-ELISA方法的建立
            1.5.3 ACP-ELISA方法的特异性和灵敏度
            1.5.4 ACP-ELISA方法田间样品的检测应用
        1.6 检测ToMMV的 dot-ELISA方法的建立及其特性分析
            1.6.1 dot-ELISA检测步骤
            1.6.2 检测ToMMV dot-ELISA方法的建立
            1.6.3 dot-ELISA方法检测ToMMV的特异性和灵敏度
            1.6.4 dot-ELISA方法田间样品的检测应用
        1.7 检测ToMMV的 Tissue print-ELISA方法的建立和应用
            1.7.1 Tissue print-ELISA操作步骤
            1.7.2 Tissue print-ELISA最适抗体工作浓度的确定
        1.8 检测ToMMV的 RT-PCR方法
            1.8.1 植物总RNA提取
            1.8.2 RT-PCR扩增
    2 实验结果及分析
        2.1 RT-PCR鉴定实验材料
        2.2 ToMMV病毒粒子的提纯
        2.3 杂交瘤细胞的融合、筛选和克隆
        2.4 抗体制备、效价测定及亚类的鉴定
        2.5 Western bolt分析单抗特异性
        2.6 检测ToMMV的 ACP-ELISA方法的建立
            2.6.1 检测ToMMV的 ACP-ELISA方法的建立
            2.6.2 ACP-ELISA方法分析单抗的特异性
            2.6.3 ACP-ELISA方法分析单抗的灵敏度
        2.7 检测ToMMV的 dot-ELISA方法建立及特异性和灵敏度分析
            2.7.1 检测ToMMV的 dot-ELISA方法的建立
            2.7.2 dot-ELISA方法的特异性
            2.7.3 dot-ELISA方法的灵敏度
        2.8 Tissue print-ELISA方法的建立及其特异性和灵敏度分析
            2.8.1 检测ToMMV的 Tissue print-ELISA方法的建立
            2.8.2 Tissue print-ELISA方法分析单抗的特异性
        2.9 血清学方法在田间样品检测中的应用
    3 讨论
第三章 猕猴桃溃疡病菌单克隆抗体的制备及其检测应用
    1 材料与方法
        1.1 菌株
        1.2 实验试剂
        1.3 菌株培养及计数
        1.4 PCR方法鉴定菌株
            1.4.1 DNA提纯方法
            1.4.2 常规PCR扩增
        1.5 单克隆抗体的制备
            1.5.1 免疫动物
            1.5.2 细胞融合、杂交瘤细胞的筛选、腹水制备和效价测定及抗体亚类鉴定
        1.6 血清学检测方法的建立及其特性分析
            1.6.1 ACP-ELISA检测方法及单抗的特异性和灵敏度
            1.6.2 dot-ELISA检测方法的特异性和灵敏度
    2 实验结果及分析
        2.1 猕猴桃溃疡病细菌菌株分子鉴定
        2.2 杂交瘤细胞的融合、筛选和克隆
        2.3 单抗腹水制备、效价测定及抗体亚类鉴定
        2.4 ACP-ELISA方法的建立及其特性分析
            2.4.1 检测Psa的 ACP-ELISA方法的建立
            2.4.2 ACP-ELISA方法的特异性分析
            2.4.3 ACP-ELISA方法的灵敏度
        2.5 dot-ELISA方法的建立及其特性分析
            2.5.1 检测猕猴桃溃疡病菌的dot-ELISA方法的建立
            2.5.2 dot-ELISA方法的特异性和灵敏度
            2.5.3 dot-ELISA方法对田间样品的检测应用
    3 讨论
全文总结
参考文献
附录A 常用生化与分子生物学试剂及仪器
附录B 常用缓冲液和培养基配方



本文编号：3880278