一株弧菌拮抗菌的鉴定、抑菌特性及应用效果的初步研究

发布时间：2017-06-01 12:20

  本文关键词：一株弧菌拮抗菌的鉴定、抑菌特性及应用效果的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：近年来,伴随着水产养殖业的迅速发展,各种养殖生物受到的病害威胁也越来越严重。病害的发生不仅带来巨大的经济损失,也给环境带来较大的影响。而为防治水产生物病害而滥用抗生素等化学药物,则会对环境和人类产生严重的影响。益生菌作为抗生素的替代品,可以抑制病原菌,为养殖动物提供营养,提高养殖动物的免疫力,改善水质条件,修复微生态环境,因此益生菌的在水产养殖中使用日渐受到人们的重视。益生菌的作用机理之一是通过产生抑菌物质来抑制病原菌的生长。因此,选择具有较高抑菌活性的细菌作为潜在的益生菌进行研究开发具有重要的实践意义。本研究对从对虾养殖环境中分离出一株对弧菌病原菌具有拮抗作用的菌株进行了鉴定、产物性质分析和应用的初步研究,旨在为将其最终应用于对虾养殖实践提供理论基础。研究获得的具体结果如下：1.一株弧菌拮抗菌的分类鉴定及其抑菌作用研究本研究从对虾养殖池塘分离筛选出一株对病原菌有拮抗作用的菌株,编号为BL1。采用十字交叉法、点种法以及牛津杯法对其进行了体外拮抗试验,以确定其抑菌谱。研究结果显示,菌株BL1对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticu)、创伤弧菌(V. vulnificus)及副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)具有明显拮抗作用。根据细菌形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析,初步鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。采用单因素分析法进一步研究了菌株BL1的最佳培养条件,确定其在培养温度28℃、初始pH7.0、接种量1%(V/V)、转速190rpm/min的条件下生长状况最好。2.菌株BL 1抑菌产物的初步分离与性质分析本研究以优化培养条件后的枯草芽孢杆菌BL1(Bacillus subtilis)发酵液为研究对象,以创伤弧菌(Vibrio vulnificus)为指示菌,采用牛津杯法作为检测方法,对菌株BL1发酵液中起抑菌作用的抑菌活性物质的性质进行了初步研究。培养时间对抑菌效果影响的实验显示,培养24h后的菌液抑菌活性最好；采用过滤、饱和硫酸铵沉淀及超滤等方法对培养24h的菌株BL1的发酵液进行初步分离纯化处理,结果显示枯草芽孢杆菌BL1发酵液中的抑菌物质为胞外分泌型、非蛋白类、分子量大于10kDa的物质；对经过初步分离纯化的抑菌物质进行稳定性的研究,发现抑菌物质对高温(60-100℃)和pH(3.0-11.0)的耐受能力比较强,对蛋白酶K不敏感。可以看出,菌株BL1所产生的抑菌物质具有很好的抑菌作用及稳定性,表明该菌株可能具有作为益生菌应用于海水养殖的潜力。3.泼洒和投喂拮抗菌BL1对凡纳滨对虾生长和水体弧菌数量的影响本研究对潜在益生菌BL1进行了菌株安全性检验后,以泼洒和投喂两种方式将菌株BL1应用于凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖中,以期了解其对凡纳滨对虾生长及水体中弧菌数量的影响。两种方式均设置3个不同的浓度梯度,其中,投喂组添加量分别为107、109和1011cfu/kg(以活菌量计),泼洒组添加量分别为106、108和1010cfu/m3,以投喂基础饲料组为对照组,泼洒周期为5天,实验共持续42天。实验过程中任选1个泼洒周期按泼洒后12h以及1、2、3、4和5d定时采样测定水体弧菌数量。实验结束时测量对虾的生长情况,饵料利用率及存活率。实验结果显示：(1)生长方面,在两种施用方式下,除了泼洒组106cfu/m3,其他处理组中菌株BL1均能显著促进对虾生长,提高对虾的特定生长率(SGR)和饵料利用率(FER)。其中,投喂组以109cfu/m3为最适浓度,泼洒组中108和1010cfu/m3两个浓度均能显著提高SGR,但是两组之间对SGR的影响差异不显著(P0.05)。(2)实验期间投喂组不同浓度的三个处理组均能有效降低弧菌数量,效果持续并且三组之间的作用规律相似；泼洒处理组在试验期间水体的弧菌数量均低于对照组,水体弧菌数量随泼洒浓度的提高而降低,以泼洒浓度为1010cfu/m3的实验组弧菌数量最低水平。但研究也发现,泼洒组弧菌数量在3-5d时会呈现一定反弹趋势。
【关键词】：益生菌 枯草芽孢杆菌 抑菌物质 特定生长率 弧菌数量
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S968.22;S917.1
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 1. 综述12-28
• 1.1 引言12-13
• 1.2 益生菌的定义13
• 1.3 益生菌的筛选13-15
• 1.3.1 益生菌的筛选原则及过程13-14
• 1.3.2 益生菌的筛选方法14-15
• 1.4 益生菌的作用机理15-17
• 1.4.1 竞争性排斥病原菌15-16
• 1.4.2 提供营养物质,促进养殖动物生长16
• 1.4.3 刺激免疫系统反应,提高免疫力16-17
• 1.4.4 改善水质条件,修复生态环境17
• 1.4.5 抗病毒作用17
• 1.5. 具有抑菌活性的益生菌17-21
• 1.5.1 常见的益生菌种类17-19
• 1.5.2 芽孢杆菌属19-21
• 1.6 益生菌在水产养殖中的应用21-23
• 1.6.1 益生菌的施用技术和剂量21-22
• 1.6.2 益生菌在水产养殖应用中存在的问题22-23
• 1.7 本实验的研究目的及意义23-24
• 参考文献24-28
• 2 一株拮抗细菌的分类鉴定及其抑菌作用的研究28-46
• 2.1 实验材料29-31
• 2.1.1 实验菌株29
• 2.1.2 培养基与试剂29-31
• 2.2 实验方法31-33
• 2.2.1. 菌株BL1抑菌谱的测定31-32
• 2.2.2 菌株BL1的分类鉴定32-33
• 2.2.3 生长曲线测定33
• 2.2.4 单因素法优化菌株的培养条件33
• 2.3 实验结果33-41
• 2.3.1 菌株BL1的抑菌谱33-34
• 2.3.2 菌株BL1的分类鉴定34-37
• 2.3.3 菌株BL1的生长曲线37-38
• 2.3.4 单因素法优化培养条件38-41
• 2.4 讨论41-44
• 2.4.1 具有抑菌作用的微生物41-42
• 2.4.2 菌株BL1的分类地位42
• 2.4.3 枯草芽孢杆菌的培养条件优化42-44
• 参考文献44-46
• 3 菌株BL1抑菌产物的初步分离与性质分析46-58
• 3.1 实验材料47-48
• 3.1.1 实验菌株47
• 3.1.2 培养基及试剂47-48
• 3.2 实验方法48-50
• 3.2.1 培养时间对菌株BL1抑菌活性的影响48
• 3.2.2 抑菌物质的初步分离纯化及鉴定48-49
• 3.2.3 温度、pH和蛋白酶K对抑菌物质的影响49-50
• 3.3 实验结果50-54
• 3.3.1 培养时间对菌株BL1抑菌活性的影响50
• 3.3.2 抑菌物质的初步分离纯化及鉴定50-52
• 3.3.3 抑菌物质的部分特性分析52-54
• 3.4 讨论54-56
• 3.4.1 菌株BL1产生的抑菌活性物质的分离纯化及鉴定54-55
• 3.4.2 抑菌活性物质的部分特性研究55-56
• 参考文献56-58
• 4 泼洒和投喂潜在益生菌BL1对凡纳滨对虾生长和水体弧菌数量变化的影响58-69
• 4.1 实验材料与实验方法59-61
• 4.1.1 实验材料59-60
• 4.1.2 实验设计及日常管理60-61
• 4.1.3 水体弧菌数量的测定61
• 4.1.4 对虾生长指标的测定61
• 4.2 数据处理与分析61
• 4.3 实验结果61-65
• 4.3.1 菌株安全性检验结果61-62
• 4.3.2 菌株BL1对水体弧菌变化的影响62-63
• 4.3.3 施用菌株BL1后对凡纳滨对虾生长指标的影响63-65
• 4.4 讨论65-67
• 4.4.1 枯草芽孢杆菌对水体弧菌数量变化的影响65
• 4.4.2 枯草芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长的影响65-67
• 参考文献67-69
• 5. 附录69-71
• 6. 致谢71
• 7. 个人简历71
• 8. 论文发表情况71

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本文编号：412603