基于龙眼转录组的SSR引物开发与应用研究

发布时间：2017-06-01 21:21

  本文关键词：基于龙眼转录组的SSR引物开发与应用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：以‘红核子’龙眼EC转录组数据为基础进行EST-SSR分子标记研究,共计开发多态性引物11对,完成EST-SSR-PCR试验体系的优化,将所优化的EST-SSR标记应用于龙眼的亲缘关系分析,并与ISSR分子标记进行比较分析。具体研究结果如下：1龙眼EST-SSR位点特征分析以本实验室已经获得的红核子龙眼EC转录组数据为材料,经MISA软件的SSR位点检索与分析,共检索出5710个EST-SSR位点,且EST-SSR位点出现频率为8.28%,位点间平均距离为5.41 kb,包含796种基元。从数量上分析,二核苷基元和三核苷基元所占比例最大,分别为43.35%和32.73%,二者共占总EST-SSR位点的76.08%,为优势核苷基元。从EST-SSR位点的基元种类来看,六核苷基元与五核苷基元的种类最多,分别为389种和244种,所占比例分别为48.87%和30.65%,二者占全部EST-SSR基元种类的79.52%。EST-SSR位点的检索结果还表明,二核苷酸基元中,(AG)n=(TC)n和(CT)n=(GA)n所占比例分别为17.55%和15.17%,是优势重复类型；而(CG)n=(GC)n重复类型出现频率最低,仅为0.00725%,表现出明显的GC偏倚性；在三核苷基元中,(AGA)n=(TCT)n是最优重复类型,占总EST-SSRs的比例为2.92%,其次为(CTT)n=(GAA)n、 (AAG)n=(TTC)n,所占比例分别为2.71%、2.59%。综上,红核子龙眼EC转录组序列中EST-SSR位点含量丰富。2龙眼EST-SSR-PCR体系的优化通过L16(44)正交试验,得到龙眼EST-SSR-PCR的最优应体系为：DNA模板80 ng,0.15 mmol/L dNTPs 2μL,0.1 μmol/L上下游引物各1 μL, Tap酶1.5 U；非优化试验因素10×PCR Buffer (1.5mM Mg2+) 2.5 μL, ddH2O补足至25μL。分别随机选取3对引物和8份龙眼种质样本的DNA作为模板对该优化体系进行验证,电泳结果显示：扩增条带清晰平整、无引物二聚体、无非特异扩增、背景干扰小,说明得到的优化体系稳定可靠。3龙眼EST-SSR多态性分析依据所分析的龙眼EST-SSR位点序列特征,使用Primer Premier 5软件共设计50对长度在18-24 bp的引物,引物对的扩增片段长度为100-300 bp。再以‘立冬本’的DNA为模板,对所设计引物的可用性进行验证,结果显示50对引物中共有19对的扩增片段符合预期大小。进一步以95份供试龙眼种质的DNA为模板进行PCR扩增,10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示,其中有11对引物扩增的多态性良好,主带明亮清晰,无拖尾、无弥散、背景干扰小,多态性引物开发得率达22%。这11对引物在95份龙眼种质中的扩增多态性表现为：共获得114条谱带,多态性位点比例达100%；多态性位点的数量分布范围在5-25个,其中LY-43引物对所扩增的多态性位点数最多(共25个),LY-9引物对的多态性位点最少(仅5个)；平均每个龙眼EST-SSR标记能够扩增10.36条多态性谱带,说明基于红核子龙眼EC转录组开发的EST-SSR标记具有丰富多态性。4龙眼EST-SSR与ISSR的比较分析本试验分别运用EST-SSR与ISSR对95份供试龙眼种质进行了亲缘关系研究。EST-SSR分子标记开发的11对引物对供试龙眼材料扩增谱带的分布范围为5-25条,分布范围较广,每对引物的平均多态位点为10.36个；ISSR分子标记所使用的10对UBC引物对供试龙眼材料扩增谱带分布范围8-12条,分布范围较窄,每对引物的平均多态位点为9.50个；EST-SSR扩增的平均多态性位点比ISSR多。此外,电泳结果表明EST-SSR标记所开发的特异引物比ISSR分子标记通用UBC引物更能高效结合到样本DNA；从开发所得的11对EST-SSR引物中获得5对特异标记：LY-5、LY-38、LY-43、LY-45、LY-48,若加大龙眼EST-SSR特异标记引物的开发力度,将有利于龙眼种质资源的鉴别。基于EST-SSR标记的聚类结果显示95份供试龙眼种质能被有效区分,聚类结果为2大组、8类群。其中,‘荔枝龙眼’单独聚为一组,表明其遗传背景独特,有别于其他龙眼种质；‘荔枝龙眼’和‘荔龙’不是同一品种。一些地方品种如‘南安1号’和‘农科所3号’被聚类在一起,表明其遗传背景相似；供试的东壁龙眼种质被聚类为不同的类群,说明不同东壁品种龙眼之间仍存在遗传多态性；此外也揭示出个别品种如‘码头1号’与‘码头2号’存在遗传差异。以上结论与ISSR标记的聚类结果契合,表明两种分子标记能揭示出龙眼聚类的共性与差异性。综合分析扩增效果及聚类结果,认为龙眼EST-SSR标记开发有效,能将其运用到龙眼亲缘关系分析中。
【关键词】：龙眼 转录组 SSR 引物开发 应用
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S667.2
【目录】：

• 缩写词9-11
• 摘要11-13
• Abstract13-17
• 第一章 引言17-25
• 1 龙眼种质资源概述17-18
• 2 分子标记在龙眼上的应用18-20
• 3 SSR分子标记技术20-22
• 3.1 SSR的定义及原理20
• 3.2 SSR分子标记的优缺点20-21
• 3.3 SSR分子标记的分类21
• 3.4 SSR标记在植物上的应用21-22
• 3.4.1 构建植物遗传连锁图谱21
• 3.4.2 植物亲缘关系及遗传多样性研究21-22
• 3.4.3 植物种质资源的鉴定分析22
• 3.4.4 开发SSR标记的途径22
• 4 本研究的目的意义及主要内容22-25
• 4.1 本研究的目的意义22-23
• 4.2 本研究的主要内容23-25
• 第二章 龙眼EST-SSR位点分析25-32
• 1 材料与方法25-26
• 1.1 转录组数据及分析软件25
• 1.2 方法25-26
• 1.2.1 龙眼转录组数据特征25
• 1.2.2 龙眼EST-SSR位点信息检索25-26
• 2 结果与分析26-29
• 2.1 龙眼EST-SSR位点信息出现频率及总体特征26
• 2.2 龙眼EST-SSR位点出现比例及长度特征26-27
• 2.3 龙眼EST-SSR位点优势基元出现频率及比例27-29
• 3 讨论29-32
• 3.1 龙眼EST-SSR位点含量丰富29-30
• 3.2 龙眼EST-SSR基元数量与种类丰富30-32
• 第三章 EST-SSR引物初筛与体系优化32-41
• 1 材料与方法32-35
• 1.1 材料32
• 1.1.1 植物材料与分析软件32
• 1.1.2 药品耗材与仪器设备32
• 1.2 方法32-35
• 1.2.1 龙眼EST-SSR标记引物设计33
• 1.2.2 龙眼总DNA提取及检测33-34
• 1.2.3 SSR-PCR反应预扩增及龙眼EST-SSR标记引物初步筛选34
• 1.2.4 龙眼SSR-PCR体系优化34-35
• 1.2.5 SSR-PCR优化体系验证35
• 2 结果与分析35-39
• 2.1 龙眼EST-SSR引物初步筛选35-37
• 2.2 SSR-PCR体系L_(16)(4~4)正交实验结果分析37-38
• 2.3 最优SSR-PCR反应体系的验证分析38-39
• 3 讨论39-41
• 3.1 龙眼SSR-PCR优化体系稳定可靠39-40
• 3.2 龙眼EST-SSR标记引物多态性良好40-41
• 第四章 龙眼EST-SSR标记在亲缘关系分析上的应用及其与ISSR的比较分析41-65
• 第一节 龙眼EST-SSR在亲缘关系分析上的应用41-51
• 1 材料与方法41-44
• 1.1 材料41-42
• 1.1.1 植物材料与分析软件42
• 1.1.2 药品耗材与仪器设备42
• 1.2 方法42-44
• 1.2.1 龙眼总DNA提取及检测42
• 1.2.2 多态性EST-SSR引物开发42
• 1.2.3 SSR-PCR体系与扩增程序42
• 1.2.4 SSR-PCR产物检测42-43
• 1.2.5 数据统计与分析43-44
• 2 结果与分析44-50
• 2.1 龙眼材料总DNA检测44
• 2.2 EST-SSR分子标记扩增结果分析44-47
• 2.3 EST-SSR分子标记引物多态性分析47
• 2.4 基于EST-SSR标记的聚类分析47-50
• 3 讨论50-51
• 3.1 龙眼EST-SSR扩增谱带多态性良好50
• 3.2 龙眼EST-SSR聚类能揭示品种差异50-51
• 第二节 ISSR在龙眼亲缘关系研究上的应用51-59
• 1 材料与方法52-53
• 1.1 材料52
• 1.1.1 植物材料与分析软件52
• 1.1.2 药品耗材与仪器设备52
• 1.2 方法52-53
• 1.2.1 龙眼总DNA提取及检测52
• 1.2.2 ISSR引物选择52-53
• 1.2.3 ISSR-PCR体系与扩增程序53
• 1.2.4 ISSR-PCR产物检测53
• 1.2.5 数据统计与分析53
• 2 结果与分析53-59
• 2.1 龙眼材料总DNA检测53-54
• 2.2 ISSR分子标记扩增结果分析54-56
• 2.3 ISSR分子标记引物多态性分析56
• 2.4 基于ISSR标记的聚类分析56-59
• 3 讨论59
• 第三节 龙眼EST-SSR与ISSR的比较分析59-65
• 1 材料与方法60
• 1.1 植物材料与分析软件60
• 1.2 方法60
• 1.2.1 电泳扩增效果比较60
• 1.2.2 聚类结果比较60
• 2 结果与分析60-62
• 2.1 EST-SSR与ISSR的扩增效果比较分析60-61
• 2.2 EST-SSR与ISSR的聚类结果比较分析61-62
• 3 讨论62-65
• 3.1 龙眼EST-SSR的特异扩增效果优于ISSR62-63
• 3.2 龙眼EST-SSR可用于龙眼亲缘关系分析63-65
• 第五章 小结65-68
• 1 龙眼EST-SSR位点含量丰富65
• 2 龙眼EST-SSR-PCR体系的优化65-66
• 3 龙眼EST-SSR标记具有丰富多态性66
• 4 龙眼EST-SSR标记与ISSR标记的比较分析66-68
• 参考文献68-74
• 附录Ⅰ 95份龙眼供试材料74-76
• 附录Ⅱ 95份龙眼供试材料的DNA检测结果76-77
• 附录Ⅲ 各EST-SSR标记引物对95份龙眼供试材料的扩增结果77-83
• 附录Ⅳ 各ISSR标记引物对95份龙眼供试材料的扩增结果83-93
• 致谢93

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本文编号：413504