水稻抗逆候选基因OsSTAP1的功能分析

发布时间：2017-06-10 04:03

  本文关键词：水稻抗逆候选基因OsSTAP1的功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：乙烯应答因子(Ethylene Responsive Factors,ERFs)是植物特有的AP2/EREBP转录因子亚家族,参与植物的生长发育、新陈代谢、抗病及各种非生物胁迫的应答过程。植物的胁迫应答过程是一个多途径、多基因参与的复杂调控过程。发掘水稻抗逆功能候选基因并验证其功能,有助于完善水稻响应环境胁迫的分子调控网络和生理调控机制,为基因工程培育抗逆新品种提供基因资源。本研究前期采用基因芯片技术分析水稻品种日本晴苗期在不同非生物胁迫处理下的表达谱变化,检测到42个胁迫差异表达的AP2/EREBP基因,其中有2个基因应答所有胁迫反应。本研究对其中一个基因(Os03g0183000)进行进一步生物信息学分析和抗逆功能验证。根据数据库中OsSTAP1基因的cDNA序列设计引物,从日本晴中扩增获得全长1005bp CDS序列,编码334个氨基酸。该基因编码蛋白包含一个AP2保守结合结构域,能特异结合GCC-box(ERE元件),AP2结构域上具有保守的A14和D19,属于ERF亚家族。聚类分析发现OsSTAP1蛋白属于ERF亚家族的第4分支,与拟南芥的抗逆蛋白AT1g53910位于同一分支。OsSTAP1基因转录调控区域存在激素响应、胁迫诱导相关顺式元件。GFP融合蛋白亚细胞定位结果显示OsSTAP1蛋白位于细胞核内。水稻经过不同激素和逆境胁迫处理后进行RT-PCR分析,结果显示OsSTAP1基因受到不同激素和逆境胁迫的诱导表达。通过农杆菌介导法转化水稻品种日本晴进一步分析OsSTAP1基因的耐盐功能。对转基因株系的RT-PCR检测和Southern blot检测发现,OsSTAP1基因整合到水稻基因组中并在大部分转基因株系中过量表达。在高盐胁迫下,转基因植株表现出较强的耐受力以及胁迫后恢复能力,并且转基因株系叶片中的SOD、POD、CAT酶的活性比野生型高。研究结果表明,OsSTAP1基因响应多种激素和逆境胁迫的诱导表达,作用于细胞核内,通过结合下游目的基因启动子区域的GCC-box等顺式作用元件,调控相关基因的表达;OsSTAP1基因的过表达使转基因株系在盐胁迫下的氧化还原酶活性增强,利于清除植物体内的氧自由基,减小盐胁迫产生的氧自由基对细胞膜造成的伤害,从而提高转基因水稻的耐盐能力。
【关键词】：水稻 AP2/EREBP转录因子 高盐 转基因
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S511;Q943.2
【目录】：

• 附件5-6
• 摘要6-7
• Abstract7-10
• 英文缩略表10-11
• 第一章 引言11-19
• 1.1 植物响应盐胁迫反应11-14
• 1.1.1 盐胁迫对植物的影响11-12
• 1.1.2 植物耐盐生理机制12-14
• 1.2 AP2/EREBP转录因子家族与盐胁迫反应14-18
• 1.2.1 AP2/EREBP转录因子家族分类14
• 1.2.2 AP2/EREBP结构域14-15
• 1.2.3 AP2/EREBP的顺式作用元件15
• 1.2.4 AP2/EREBP家族成员进化关系15-17
• 1.2.5 ERF类蛋白的功能17-18
• 1.3 研究的目的与意义18-19
• 第二章 材料与方法19-29
• 2.1 实验材料19-20
• 2.1.1 植物材料19
• 2.1.2 载体与菌株19
• 2.1.3 引物、酶及主要试剂19-20
• 2.2 实验方法20-29
• 2.2.1 生物信息学分析20
• 2.2.2 构建OsSTAP1的过表达载体20-22
• 2.2.3 对水稻进行遗传转化22-24
• 2.2.4 转基因植株阳性检测24
• 2.2.5 转基因植株OsSTAP1基因表达量鉴定24-25
• 2.2.6 Southern Blot检测25-26
• 2.2.7 OsSTAP1蛋白亚细胞定位26-27
• 2.2.8 检测OsSTAP1基因诱导表达特性27
• 2.2.9 鉴定转基因材料耐盐性27
• 2.2.10 测定转基因材料耐盐生理指标27-29
• 第三章 结果与分析29-41
• 3.1 生物信息学分析29-34
• 3.1.1 OsSTAP1序列分析29-31
• 3.1.2 OsSTAP1基因的聚类分析31
• 3.1.3 OsSTAP1基因的转录调控元件分析31-34
• 3.2 OSSTAP1蛋白的亚细胞定位34
• 3.3 OSSTAP1响应外界环境刺激的表达模式分析34-35
• 3.4 OSSTAP1基因过表达转基因材料的获得35-36
• 3.4.1 构建OsSTAP1基因过表达载体35-36
• 3.4.2 遗传转化并获得转化植株36
• 3.5 转基因材料的鉴定36-38
• 3.5.1 hgy标记基因的PCR阳性检测36-37
• 3.5.2 RT-PCR检测OsSTAP1基因表达量37
• 3.5.3 Southern Blot检测37-38
• 3.6 过表达OSSTAP1基因对水稻耐盐性的影响38-41
• 3.6.1 过表达OsSTAP1基因对水稻耐盐性的影响38
• 3.6.2 过表达OsSTAP1基因对水稻耐盐生理的影响38-41
• 第四章 讨论41-43
• 4.1 ERFS的生物学功能及结构特征分析41
• 4.2 OSSTAP1响应不同环境胁迫反应41-42
• 4.3 过表达OSSTAP1提高水稻耐盐性42-43
• 第五章 全文结论43-44
• 参考文献44-50
• 致谢50-51
• 作者简历51

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 孙建昌;王兴盛;杨生龙;;植物耐盐性研究进展[J];干旱地区农业研究;2008年01期

2 李培玉;张锐;孙国清;马林;薛计雄;林芹;郭三堆;;转vgb基因油菜的耐涝性[J];生物技术进展;2014年04期

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本文编号：437331