青稞查尔酮异构酶基因的克隆及原核表达分析

发布时间：2017-07-05 11:21

  本文关键词：青稞查尔酮异构酶基因的克隆及原核表达分析

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【摘要】：青稞(Qingike, Hordeum vulgare L. var. nudum Hook. F)也称裸大麦,其籽粒富含黄酮等营养功能成分,具有较高的营养价值和医疗保健作用,已越来越受大麦研究者的青睐。黄酮类化合物是一类在自然界广泛分布的多酚类次生代谢物质,是色原烷或色原酮的衍生物,在植物自身生理活动中起着重要的作用,参与紫外线防护、花色形成、调节生长、抗病原微生物、诱导植物与微生物相互作用等,与人类的健康有密切的联系,具有清除自由基、保护心脑血管、抗肿瘤、抗氧化和抗炎症等多种药用价值。类黄酮代谢是植物中重要的次生代谢途径之一,是植物黄酮合成的重要方式。查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI,EC5.5.1.6)是第一个被认识的黄酮类物质合成相关酶,也是类黄酮代谢途径中的一个关键酶,催化分子内环化反应将双环的查尔酮转化为有生物学活性的三环二羟基黄烷酮,对黄酮类物质的合成具有重要作用。本研究以实验室筛选的高黄酮青稞品种“94-19-1”为材料,通过同源克隆获得青稞查尔酮异构酶基因HvCHI的编码序列CDS(Coding sequence)全长,对序列进行了生物信息学分析和进化树分析,构建原核表达载体并进行了原核表达初步研究,为深入研究CHI基因在青稞类黄酮代谢中的分子调控机制提供依据,对青稞高黄酮含量的育种具有指导价值。主要结果如下：1.根据GenBank中已登录的大麦CHI基因的CDS区序列设计引物,通过同源克隆及测序成功得到青稞CHI基因的CDS区全序列,CDS区全长696 bp,编码231个氨基酸。酶蛋白分子量为23.68 KDa,预测等电点(PI)为5.22,为酸性蛋白。酶蛋白的不稳定系数为23.96,属于稳定蛋白。其所有氨基酸组成中Ala最多,Cys、Gln和Trp最少。平均亲水指数为0.299,属于亲水性蛋白。存在5个丝氨酸和1个酪氨酸磷酸化活性位点。信号肽预测结果显示,该蛋白无信号肽。预测该酶蛋白为非分泌性蛋白。二硫键预测软件分析表明,在Cys113和Cys183一个区域可能存在二硫键。2.对包括青稞在内的14种植物的CHI基因序列构建NJ系统进化树表明：该进化树分为2个亚群：单子叶植物(Ⅱ)和双子叶植物(Ⅰ)。其中Ⅰ类包含了矮牵牛、葡萄、百脉根、金荞麦、苜宿、菜豆等植物；Ⅱ类包括普通小麦、玉米、大麦和节节麦等植物。青稞CHI基因与同为单子叶的大麦、节节麦等的同源性最高,与双子叶植物的橙子、矮牵牛同源性最低。3.将青稞CHI基因的编码序列与表达载体pET-32a相连后,pET-32a-HvCHI在大肠杆菌BL21中进行原核表达, HvCHI基因编码的蛋白与pET-32a表达载体上的标签蛋白形成44 KDa左右的融合蛋白,与预测结果一致。本试验原核表达的诱导浓度为0.5 mM,第4 h的融合蛋白量最大,并对融合蛋白进行了初步纯化。
【关键词】：大麦 青稞 查尔酮异构酶基因 克隆 原核表达
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S512.3;Q943.2
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 主要缩略符号对照表8-12
• 1 文献综述12-22
• 1.1 青稞概述12
• 1.2 黄酮概述12-17
• 1.2.1 植物自身生理功能15
• 1.2.2 清除自由基及抗氧化作用15-16
• 1.2.3 抗癌抗肿瘤的作用16
• 1.2.4 抗抑郁作用16-17
• 1.2.5 其他功能17
• 1.3 CHI基因概述17-21
• 1.3.1 CHI基因的发现18-19
• 1.3.2 CHI基因的结构与类型19-20
• 1.3.3 CHI基因的表达调控20
• 1.3.4 CHI基因的转基因应用20-21
• 1.4 目的与意义21-22
• 2 材料和方法22-38
• 2.1 实验材料22-24
• 2.1.1 实验植物材料22
• 2.1.2 实验主要仪器和试剂22
• 2.1.3 实验菌株和载体22-23
• 2.1.4 实验试剂溶液的配制23-24
• 2.2 青稞CHI基因CDS区的克隆24-29
• 2.2.1 总RNA提取24-25
• 2.2.2 反转录：cDNA第一链的合成25-26
• 2.2.3 引物设计26
• 2.2.4 PCR扩增26-27
• 2.2.5 目的片段回收和纯化27-28
• 2.2.6 目的片段与载体的连接28-29
• 2.2.7 阳性克隆鉴定及测序29
• 2.3 生物信息学分析29-31
• 2.3.1 HvCHI蛋白的理化性质与等电点预测29
• 2.3.2 HvCHI蛋白的亲水性预测29-30
• 2.3.3 HvCHI蛋白的二级结构预测30
• 2.3.4 HvCHI基因CDS区密码子的偏倚性分析30
• 2.3.5 HvCHI蛋白的跨膜预测30
• 2.3.6 HvCHI蛋白的糖基化位点及磷酸化位点预测30
• 2.3.7 HvCHI蛋白的信号肽预测30-31
• 2.3.8 HvCHI蛋白的二硫键、亚细胞定位及稀有密码子预测31
• 2.3.9 HvCHI蛋白的三级结构31
• 2.4 HvCHI基因的原核表达31-38
• 2.4.1 酶切引物的设计31
• 2.4.2 PCR扩增及回收31-32
• 2.4.3 HvCHI基因与T载体的连接32
• 2.4.4 HvCHI基因的转化与鉴定32
• 2.4.5 构建原核表达载体32-35
• 2.4.6 重组蛋白的表达35-36
• 2.4.7 SDS-PAGE电泳36-37
• 2.4.8 融合蛋白初步纯化37-38
• 3 结果与分析38-57
• 3.1 RNA的检测38
• 3.2 HvCHI基因的PCR扩增38-40
• 3.3 HvCHI基因的原核表达40-42
• 3.4 SDS-PAGE分析42-44
• 3.5 生物信息学分析44-57
• 3.5.1 核苷酸序列分析44-45
• 3.5.2 序列分析及进化树的构建45-48
• 3.5.3 HvCHI蛋白的理化性质分析与等电点预测48-49
• 3.5.4 HvCHI蛋白的亲水性预测49-50
• 3.5.5 HvCHI蛋白的二级结构预测50-51
• 3.5.6 HvCHI基因CDS区密码子的偏倚性分析51
• 3.5.7 HvCHI蛋白的跨膜预测51-52
• 3.5.8 HvCHI蛋白的糖基化及磷酸化位点预测52-53
• 3.5.9 信号肽预测53-54
• 3.5.10 二硫键、亚细胞定位及稀有密码子预测54-55
• 3.5.11 结构域预测55
• 3.5.12 HvCHI蛋白的三级结构55-57
• 4 讨论57-60
• 5 结论60-61
• 参考文献61-70
• 致谢70-71
• 攻读硕士期间发表的论文71

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