猪圆环病毒2型Cap蛋白原核表达及间接ELISA方法的建立

发布时间：2017-07-16 03:05

  本文关键词：猪圆环病毒2型Cap蛋白原核表达及间接ELISA方法的建立

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【摘要】：猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)被公认为在世界范围养猪业中造成严重经济影响的最重要的病毒之一。由于病毒、宿主的免疫力、混合感染情况和其他环境特征的差异,PCV2能引起不同的疾病,统称为圆环病毒病(porcine circovirus diseases, PCVDs)。我国是一个养猪大国,PCVDs在我国一直呈上升趋势,给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。血清抗体的检测常被用来分析PCV2的感染情况以及评价疫苗的免疫效果。ELISA因其敏感、特异、检测快速、简便等优点,而被广泛应用。然而研究表明,国内检测PCV2抗体的ELISA试剂盒普遍存在敏感性偏低的问题,而进口试剂盒因其价格昂贵,难于普及应用。因此,建立一种快速、简便、敏感、特异的诊断方法对于PCV2的预防和控制具有重要意义。本研究利用PCR方法扩增PCV2 ORF2全长基因,构建原核表达载体pET-30a-Cap,转化E. coli BL21(DE3)。在SDS-PAGE分析基础上,结合ImageJ和Graphpad prism 5.0软件的分析,对影响重组Cap蛋白表达的诱导温度,诱导起始OD600， IPTG浓度及诱导时间等因素进行了优化,确定最佳表达条件为：当菌体浓度达到1.0～1.5时,加入终浓度为0.2 mM的IPTG,37℃恒温摇床175 rpm振荡培养5h。为得到高纯度的重组Cap蛋白,对重组Cap蛋白纯化条件进行了探索,确定蛋白洗涤液中咪唑浓度为100 mM,蛋白洗脱液中咪唑浓度为300 mM。纯化后的蛋白进行Western blot鉴定,重组Cap蛋白只与PCV2标准阳性血清反应,与E.coli BL21(DE3)阳性血清和pET-30a/ BL21(DE3)阳性血清均不发生反应,表明纯化的重组Cap蛋白具有良好的特异性和反应原性。以纯化的重组Cap蛋白为包被抗原,优化试验条件,建立了PCV2 Cap-ELISA检测方法：抗原包被条件为3 μg/mL,4℃包被过夜；封闭液为5%马血清+2.5%BD脱脂乳,37℃封闭2 h；血清作用条件为200×,37℃孵育45 min；兔抗猪HRP-IgG稀释度为5000×,37℃孵育45 min；显色条件为37℃,15 min；利用TG-ROC方法确定临界值为0.26即当S/P≥0.26时,结果判定为阳性；S/P0.26时,结果判定为阴性。该方法与PRV阳性血清、TGEV阳性血清、RV阳性血清、PPV阳性血清无交叉反应。组装的试剂盒的批内和批间重复性试验结果变异系数分别为0.32%-7.8%和1.09%-7.71%,具有良好重复性。在与8种市售试剂盒的符合率对比试验中,同3种进口试剂盒的符合率分别为89.22%、83.83%和89.22%,符合率较高且一致；同5种国产试剂盒的符合率分别为67.67%、80.23%、54.49%、65.87%、71.25%和84.43%,符合率参差不齐。表明,PCV2 Cap-ELISA抗体检测试剂盒检测结果可靠,能用于临床样品的检测。
【关键词】：PCV2 Cap蛋白 优化表达 抗原性 ROC ELISA
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.651
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 1 绪论10-18
• 1.1 课题背景10
• 1.2 PCV2病毒学概论10-11
• 1.3 PCV2流行情况11-12
• 1.4 PCV2感染情况12-13
• 1.4.1 宿主的易感性12
• 1.4.2 传播途径12-13
• 1.5 PCV2诊断技术13-16
• 1.5.1 临床诊断及病理组织变化13-14
• 1.5.2 病毒分离与鉴定14
• 1.5.3 血清学诊断技术14-15
• 1.5.4 PCV2病原学诊断技术15-16
• 1.6 PCV2防治与控制16-17
• 1.7 研究目的与意义17-18
• 2 猪圆环病毒2型Cap蛋白的原核表达及重组菌遗传稳定性鉴定18-32
• 2.1 材料18
• 2.1.1 血清、质粒和菌株18
• 2.1.2 主要试剂18
• 2.1.3 主要仪器18
• 2.2 方法18-23
• 2.2.1 PCV2 Cap蛋白基因的获取18-19
• 2.2.2 重组质粒的构建及鉴定19-20
• 2.2.3 重组Cap蛋白的表达20-21
• 2.2.4 重组Cap蛋白表达条件的优化21-22
• 2.2.5 重组Cap蛋白的纯化22-23
• 2.2.6 纯化产物的抗原性鉴定23
• 2.2.7 重组质粒pET-30a-Cap稳定性鉴定23
• 2.3 结果23-30
• 2.3.1 PCV2 Cap基因的PCR扩增结果23-24
• 2.3.2 重组质粒pET-30a-Cap的鉴定24
• 2.3.3 重组Cap蛋白的SDS-PAGE分析24-25
• 2.3.4 重组Cap蛋白的Western blot鉴定25
• 2.3.5 重组Cap蛋白表达条件优化结果25-27
• 2.3.6 重组Cap蛋白的纯化条件27-28
• 2.3.7 重组Cap蛋白大量纯化结果28
• 2.3.8 重组Cap蛋白抗原性鉴定结果28-29
• 2.3.9 重组质粒pET-30a-Cap稳定性鉴定29-30
• 2.4 讨论30-31
• 2.5 本章小结31-32
• 3 猪圆环病毒2型间接ELISA检测方法的建立及初步应用32-47
• 3.1 材料32
• 3.1.1 血清32
• 3.1.2 主要试剂32
• 3.1.3 主要仪器32
• 3.2 方法32-35
• 3.2.1 重组Cap蛋白间接ELISA方法的建立及条件优化32-33
• 3.2.2 阴阳性临界值的确定33
• 3.2.3 敏感性试验33-34
• 3.2.4 特异性试验34
• 3.2.5 PCV2 Cap-ELISA抗体检测试剂盒的组份34
• 3.2.6 重复性试验34
• 3.2.7 保存期试验34-35
• 3.2.8 与商品化试剂盒符合率比较35
• 3.3 结果35-45
• 3.3.1 重组Cap蛋白间接ELISA方法的建立及条件优化结果35-39
• 3.3.2 阴阳性临界值的确定39-40
• 3.3.3 敏感性试验40-41
• 3.3.4 特异性试验41-42
• 3.3.5 重复性试验42-44
• 3.3.6 保存期试验44
• 3.3.7 与商品化试剂盒符合率比较44-45
• 3.4 讨论45-46
• 3.5 本章小结46-47
• 结论47-48
• 参考文献48-55
• 附录55-56
• 攻读学位期间发表的学术论文56-57
• 致谢57-58

【参考文献】

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本文编号：546797