山羊地方性鼻内腺瘤microRNA的表达差异研究

发布时间：2017-08-15 12:26

  本文关键词：山羊地方性鼻内腺瘤microRNA的表达差异研究

  更多相关文章： miRNA 山羊地方性鼻内肿癌 Illumina高通量测序 RT-PCR

【摘要】：山羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal Tumor, ENT),又称山羊地方性鼻内腺瘤,是由山羊地方性鼻内肿瘤病毒(Enzootic Nasal Tumor Virus of Goats, ENTV-2)引起的一种慢性、进行性、接触性传染病。该病发病率为5%-15%,至今没有有效的措施进行早期诊断,一旦出现临床症状,几乎都以死亡告终。ENTV体外培养体系的缺乏,使该病毒的致瘤机制和免疫特性研究遇到了阻碍。MicroRNA(miRNA)是一类非编码RNA,长度约为21-24nt。研究表明,miRNA在人类多个癌症研究中发挥了重要的作用。本研究基于肿瘤与miRNA的密切关系,通过Illumina高通量测序及荧光定量PCR技术,利用生物信息学软件和NCBI等数据库信息,发掘在山羊鼻肿瘤组织和癌旁组织中差异性表达的miRNA及其靶标的功能和所涉及到的信号通路。利用生物信息学软件,将测序所得的有效数据与Rfam以及EST等数据库比对去除非miRNA,余下序列与山羊基因组比对,获得新miRNA,用RNAfold二级结构预测软件识别新miRNA的成熟体和前体,利用miRDeep软件结合近缘物种同源的miRNA序列,采用假阳性率对预测结果给予评价。采用TPM计算度量指标计算所获得的miRNA在肿瘤组和对照组中的表达量,利用DESeq软件筛选出肿瘤组相对于对照组满足p0.05和大于等于2倍差异表达范围的差异miRNA 。利用miranda算法从miRNA-3'UTR序列匹配得分和能量稳定性评估,使用阈值参数：Scores≥150,△G-30 kcal/mol和严格的种子区域配对,预测miRNA的靶基因。用Gene ontology、KEGG pathway分析软件结合NCBI数据库的信息,对满足条件的差异性表达miRNA的靶标进行功能注释和分类,并找出靶标所参与的信号通路,致力于揭示miRNA在肿瘤形成中的作用。应用荧光定量PCR,根据测序所得序列设计引物,对7个已知miRNA和2个新发现的miRNA进行了验证。实验结果显示：406条为已知miRNA,29条为新发现miRNA,其中只在肿瘤组或对照组表达的有34条(包含3条新]miRNA);肿瘤组相对于对照组有116条miRNA有显著表达差异,其中54条在肿瘤组中下调,60条在肿瘤组织上调,有2条只在对照组中表达。另外,在功能分析中,预测出显著差异表达121 miRNA(116条显著差异表达的miRNA和5条star序列)的非沉余靶标共6925个以及1792条显著富集GO和97条显著富集KEGG pathway。 GO和KEGG pathway功能分析显示所占比例最大的6个通路分别为MAPK signaling pathway、Ras signaling pathway、prolactin signaling pathway、 Pathways in cancer、Viral carcinogenesis和MicroRNA in cancer,部分基因涉及到细胞分化、凋亡,代谢等重要生命过程,我们预测chi-mir-133a、chi-mir-145-5p、mchi-mir-146a/200a可能作用于靶基因BRAF而通过对MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路,影响了细胞的正常分裂周期,促进了细胞的增殖,对ENA的形成起到了促进作用。预测chi-mir-874-3p作用于靶标VEGFA、chi-mir-148a-3p作用于靶标 TGFβRAP1,可能使得肿瘤细胞逃脱了TGFβ的抑制生长作用,对ENA的发生、发展创造了条件；而低表达的金属蛋白酶和Syndecan在ENA的浸润转移中发挥了抑制作用。经过荧光定量PCR的验证得出：被检测的9条miRNAs中,所有候选miRNA的表达趋势同高通量测序结果一致,其中chi-miR-218在测序和qPCR验证中都表现出了在肿瘤组下调,但下调的倍数有所差异,而2条新miRNA的成功扩增,显示它们确实是存在于组织中的,也暗示了本次测序的可靠性。本研究首次对山羊ENA中miRNA进行大规模鉴定,为阐明复杂而精确的miRNA-mRNA调控网络和ENA的发展过程提供参考。
【关键词】：miRNA 山羊地方性鼻内肿癌 Illumina高通量测序 RT-PCR
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.27
【目录】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 符号说明9-13
• 1. 文献综述13-24
• 1.1 山羊地方性鼻内腺瘤14
• 1.2 MIRNA的生物合成与在肿瘤中的功能14-16
• 1.3 MIRNA与肿瘤16-20
• 1.3.1 乳腺肿瘤与miRNA16-18
• 1.3.2 人类肺癌中代表性miRNA18-19
• 1.3.3 人类鼻咽癌与miRNA19-20
• 1.4 MIRNA的预测与鉴定20-24
• 1.4.1 miRNA微阵列芯片与实时PCR连用检测已知miRNA的表达差异20-21
• 1.4.2 直接克隆法和生物信息学相结合寻找新miRNA21-22
• 1.4.3 构建重组载体与Western blot联用检测特定miRNA对某肿瘤相应基因表达蛋白的影响22-23
• 1.4.4 第二代高通量测序技术和生物信息学相结合寻找新miRNA23-24
• 1.5 研究的目的意义24
• 2. 材料与方法24-39
• 2.1 材料24-27
• 2.1.1 组织材料、菌株24
• 2.1.2 主要试剂和溶液配制24-25
• 2.1.3 主要仪器设备25-26
• 2.1.4 使用的数据库及分析软件26-27
• 2.2 方法27-39
• 2.2.1 总RNA的抽提27-28
• 2.2.2 Illumina深度测序的试验流程28-29
• 2.2.3 Illumina深度测序的生物信息分析29-33
• 2.2.4 PCR引物33-34
• 2.2.5 候选miRNA的真实性检测34-38
• 2.2.6 候选miRNA表达谱的qPCR验证38-39
• 3. 结果39-55
• 3.1 山羊ENA肿瘤组织小分子RNA的深度测序39-51
• 3.1.1 总RNA的提取结果39
• 3.1.2 小分子RNA的序列信息39-42
• 3.1.3 小分子RNA序列的分类注释42-43
• 3.1.4 山羊鼻组织中已知miRNA分析43-50
• 3.1.5 山羊鼻组织中新发现的miRNA分析50-51
• 3.2 部分候选MIRNA的PCR分析51-55
• 3.2.1 部分候选miRNA的普通PCR分析51-53
• 3.2.2 部分候选miRNA的荧光定量PCR分析53-55
• 4. 讨论55-61
• 4.1 ILLUMINA HISEQ测序的优势与不足55-56
• 4.2 ILLUMINA HISEQ测序数据质量的可靠性56-57
• 4.3 MIRNA的靶基因预测57-58
• 4.4 部分重要MIRNA靶基因的作用方式58-61
• 5. 结论61-62
• 参考文献62-69
• 致谢69-70
• 攻读学位期间发表的学术论文目录70

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