利用EMS诱变获得甜橙抗溃疡病突变体的研究

发布时间：2017-08-18 23:21

  本文关键词：利用EMS诱变获得甜橙抗溃疡病突变体的研究

  更多相关文章： 柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri) 甲基磺酸乙酯(EMS) 肽聚糖(peptidoglycan PGN) LYP2基因 CERK1基因 CsLOB1基因

【摘要】：柑橘溃疡病是由柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种Xanthomonas citri subsp. citri(又名为：地毯草黄单胞杆菌柑桔致病变种X.axonopodis pv. citri)引起的一种细菌性病害,也是一种世界性检疫性病害,它严重危害国内外的柑橘产业。柑橘是我国南方地区第一大水果,而大多柑橘商业品种都易感溃疡病,因此寻找抗病资源、培育抗病的商用品种是解决此问题的根本途径。因此,本文利用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(Ethyl Methane Sulphonate, EMS)对甜橙实生苗上胚轴进行离体诱变,通过用不同浓度溃疡病菌粗提物进行离体筛选,确定了适宜的抗溃疡病选择压,并经过离体接种、活体接种鉴定以期获得较为稳定的抗性材料,为研究柑橘抗溃疡病菌的机理提供重要研究材料以及理论基础。同时为了验证柑橘溃疡病菌肽聚糖是否能特异诱导柑橘体内免疫反应的病原相关分子模式,本文还分别将柑橘溃疡病菌和其细胞壁成分之一肽聚糖接种感病品种冰糖橙和抗病突变体材料,分析接种前后各感、抗病材料中LYP2和CERK1基因的表达情况,以及分析了接种溃疡病菌后引起感病基因CsLOBl在各抗病突变体材料中的表达情况,主要研究结果如下：1、以不同浓度梯度的EMS溶液对大红甜橙上胚轴节间茎段进行诱变处理,根据EMS对不定芽再生率产生半致死效应的浓度和处理时间分别为：1.8%(v/v),处理2h。建立甜橙EMS诱变技术体系。2、验证了溃疡病菌粗提物对冰糖橙嫩梢具有危害作用,通过以不同浓度梯度溃疡病菌粗提物对大红甜橙上胚轴节间茎段进行离体选择培养,得到其临届致死效应的浓度为4%(v/v),建立甜橙抗性离体筛选体系。3、将半致死剂量的EMS诱变结合两次不连续溃疡病菌粗提物临届致死浓度的离体选择,成功筛选到抗XccE的大红甜橙突变体10株。经离体接种验证,突变体株系149,278,376表现出比较稳定的抗病性。4、从柑橘溃疡病菌中提取肽聚糖,并将其和溃疡病菌分别活体接种冰糖橙和抗病突变体149、278和376。结果显示,在两种接种情况下,CERK1和LYP2在冰糖橙叶片中下调表达；CERK1在149、278和376中呈上调表达趋势,376中表达差异最为显著,而LYP2在376中呈上调表达,在149和278中几乎维持初始水平。因此,CERK1和LYP2可能是抗病突变体初始抗病过程中的关键基因,且在柑橘中可能存在由CERK1和LYP2作为组成成分构成肽聚糖的识别系统。5、溃疡病菌能诱导感病材料冰糖橙和抗病突变体149、278中CsLOBl基因表达水平上调,但在冰糖橙中的表达量要远远高出在抗病突变体中的表达量；在376中其表达差异不显著。因此认为376株系抗病能力最强,149和278株系为中等抗病。
【关键词】：柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri) 甲基磺酸乙酯(EMS) 肽聚糖(peptidoglycan PGN) LYP2基因 CERK1基因 CsLOB1基因
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S436.66
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 缩略词表8-11
• 第一章 前言11-20
• 1.1 研究目的及意义11-13
• 1.2 国内外研究进展13-17
• 1.2.1 化学诱变剂在植物育种中的应用13-15
• 1.2.2 EMS在诱变育种中的应用15-17
• 1.3 植物与病原菌的互作模式研究进展17-20
• 第二章 甜橙实生苗节间茎段EMS诱变体系的建立20-28
• 2.1 材料与方法20-21
• 2.1.1 试验材料与试剂20-21
• 2.2 试验方法21-22
• 2.2.1 材料准备21
• 2.2.2 甜橙上胚轴节间茎段对EMS敏感度的检测21
• 2.2.3 EMS诱变甜橙半致死剂量的确定21
• 2.2.4 不定芽的诱导生根及驯化移栽21-22
• 2.3 结果与分析22-26
• 2.3.1 甜橙上胚轴节间茎段对EMS敏感度的检测22
• 2.3.2 EMS诱变甜橙半致死剂量的确定22-26
• 2.3.3 不定芽的诱导生根及驯化移栽26
• 2.4 讨论26
• 2.5 小结26-28
• 第三章 甜橙抗溃疡病突变体的筛选28-42
• 3.1 材料与方法29
• 3.1.1 试验材料与试剂29
• 3.2 试验方法29-32
• 3.2.1 材料准备29-30
• 3.2.2 溃疡病菌提取液的制备及其对感病材料生长的影响30
• 3.2.3 甜橙抗溃疡病粗提物突变体的筛选30-32
• 3.3 结果与分析32-39
• 3.3.1 抗溃疡病选择压的确定32-33
• 3.3.2 抗性突变体的筛选33-39
• 3.4 讨论39-41
• 3.5 小结41-42
• 第四章 抗溃疡病突变体LYP2、CERK1及CSLOB1基因的表达分析42-54
• 4.1 材料与方法44
• 4.1.1 供试材料与试剂44
• 4.2 试验方法44-48
• 4.2.1 接种菌液的准备44-45
• 4.2.2 PGN_((XCC))的提取45
• 4.2.3 活体接种PGN_((XCC))、溃疡病菌及样品的采集45-46
• 4.2.4 引物合成46
• 4.2.5 感病冰糖橙和甜橙抗病突变体总RNA的提取46-47
• 4.2.6 CDNA的合成47
• 4.2.7 LYP2、CERK1和CSLOB1基因表达分析47-48
• 4.3 结果与分析48-52
• 4.3.1 活体接种肽聚糖和溃疡病菌后CERK1基因的相对量表达分析48-50
• 4.3.2 活体接种肽聚糖和溃疡病菌后LYP2基因的相对量表达分析50
• 4.3.3 活体接种溃疡病菌后CSLOB1基因的相对量表达分析50-52
• 4.4 讨论52-53
• 4.5 小结53-54
• 全文主要结论54-55
• 创新点55
• 下一步工作计划55-56
• 参考文献56-67
• 致谢67-68
• 个人简历68

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