致病性坏死梭杆菌120ku血凝素相关外膜蛋白基因的克隆及其特性分析

发布时间：2017-08-25 11:21

  本文关键词：致病性坏死梭杆菌120ku血凝素相关外膜蛋白基因的克隆及其特性分析

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【摘要】：坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)是一种严格厌氧的革兰氏阴性杆菌,具有多形性,常引起人的急性咽炎综合征(Lemierre's Syndrome)和牛、羊、鹿等动物的腐蹄病、肝脓肿、坏死性皮炎、犊牛白喉。目前还没有商品化的坏死梭杆菌疫苗,国内外主要使用抗生素来治疗该病,但是抗生素带来的负面影响越来越受到人们重视,为了研究120 ku血凝素相关外膜蛋白的生物学特性,并揭示其作为基因工程亚单位疫苗预防坏死杆菌病的可行性,本研究根据已报道的F.necrophorum 120 ku血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷酸序列,克隆出该基因完整的核苷酸序列,生物信息学分析了该蛋白的分子特征,参考抗原表位预测结果,将F.necrophorum 120 ku血凝素相关外膜蛋白基因的开放阅读框(Open reading frame)分为3个彼此重叠的基因片段p1、p2、p3,进行原核表达,纯化的重组蛋白P1、P2、P3分别免疫实验兔,检测兔血清中特异性抗体水平,主要研究内容如下:1.根据已报道的F.necrophorum 120 ku血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷酸序列(登录号:AF529887.1),采用染色体步移技术,克隆出该基因完整的核苷酸序列并用高保真酶进行验证,全长4 247 bp,含有一个3 372 bp的ORF,编码1 123个氨基酸,蛋白质的分子质量约为120 ku。生物信息学分析表明,该蛋白可能是具有血凝活性的外膜自转运蛋白家族成员,并具有较强的抗原性。2.F.necrophorum 120 ku血凝素相关外膜蛋白的原核表达及纯化。参考抗原表位预测结果,将F.necrophorum 120 ku血凝素相关外膜蛋白基因的ORF分为3个彼此重叠60 bp左右的基因片段p1、p2、p3,构建重组表达载体p ET-28a-p1、p ET-32a-p2、p ET-32a-p3,在大肠杆菌中进行诱导表达,利用AKTA purifier蛋白纯化系统获得48 ku、59 ku、62 ku的重组蛋白P1、P2、P3,Western blot分析显示,纯化后的重组蛋白P1、P2、P3具有良好的反应原性。3.将纯化的重组蛋白P1、P2、P3分别免疫实验兔,检测兔血清中的特异性抗体,结果显示,兔血清中的抗体效价分别为1:32、1:16、1:16,表明重组蛋白均可诱导实验兔产生特异性抗体,具有良好的免疫原性。综上所述,F.necrophorum 120 ku血凝素相关外膜蛋白基因的克隆及其免疫原性的初步分析,为进一步了解120 ku血凝素相关外膜蛋白的生物学功能提供理论基础,并为基因工程亚单位疫苗和诊断制剂的研制提供了物质材料。
【关键词】：坏死梭杆菌 120 ku血凝素相关外膜蛋白 染色体步移 免疫原性分析
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-14
• 英文缩略表14-15
• 第一章 引言15-21
• 1.1 坏死梭杆菌概述15-18
• 1.1.1 坏死梭杆菌病原特征15-16
• 1.1.2 坏死梭杆菌的致病机理16
• 1.1.3 坏死梭杆菌的检测16-18
• 1.2 未知基因的克隆18-20
• 1.2.1 探针法18
• 1.2.2 接头法18
• 1.2.3 差减杂交18
• 1.2.4 图位克隆18-19
• 1.2.5 同源克隆19
• 1.2.6 反向PCR19-20
• 1.2.7 cDNA末端快速扩增20
• 1.3 本研究的目的及意义20-21
• 第二章 致病性坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的克隆与生物信息学分析21-33
• 2.1 材料与方法21-25
• 2.1.1 菌种、载体和试剂21
• 2.1.2 主要仪器21-22
• 2.1.3 引物设计与合成22
• 2.1.4 FN(AB)基因组DNA的提取22
• 2.1.5 FN(AB)120 ku血凝素相关外膜蛋白基因 5’端旁侧序列的克隆与测序22-24
• 2.1.6 FN(AB)120 ku血凝素相关外膜蛋白基因 3’端旁侧序列的克隆与测序24
• 2.1.7 FN(AB)120 ku血凝素相关外膜蛋白基因 5’端旁侧序列的验证24
• 2.1.8 FN(AB)120 ku血凝素相关外膜蛋白基因 3’端旁侧序列的验证24
• 2.1.9 FN(AB)120 ku血凝素相关外膜蛋白基因的序列分析24
• 2.1.10 FN(AB)120 ku血凝素相关外膜蛋白的生物信息学分析24-25
• 2.2 结果与分析25-31
• 2.2.1 FN(AB)120 ku血凝素相关外膜蛋白基因 5’端旁侧序列的克隆与测序25-26
• 2.2.2 FN(AB)120 ku血凝素相关外膜蛋白基因 3’端旁侧序列的克隆与测序26
• 2.2.3 FN(AB)120 ku血凝素相关外膜蛋白基因 5’端旁侧序列的验证26-27
• 2.2.4 FN(AB)120 ku血凝素相关外膜蛋白基因 3’端旁侧序列的验证27
• 2.2.5 FN(AB)120 ku血凝素相关外膜蛋白基因的序列分析27-28
• 2.2.6 FN(AB)120 ku血凝素相关外膜蛋白的生物信息学分析28-31
• 2.3 讨论31-33
• 第三章 致病性坏死梭杆菌 120 ku血凝素相关外膜蛋白基因的分段克隆及表达载体的构建33-43
• 3.1 材料与方法33-37
• 3.1.1 菌种与载体33
• 3.1.2 主要试剂33
• 3.1.3 主要仪器33-34
• 3.1.4 引物设计与合成34
• 3.1.5 基因片段p1、p2、p3的PCR扩增34-35
• 3.1.6 基因片段p1、p2、p3 PCR产物的回收35
• 3.1.7 重组克隆质粒的构建35
• 3.1.8 重组克隆质粒转化E.coli Trans T135
• 3.1.9 重组克隆质粒的提取35
• 3.1.10重组克隆质粒的PCR鉴定35
• 3.1.11重组克隆质粒的双酶切鉴定35-36
• 3.1.12重组克隆质粒的测序鉴定36
• 3.1.13重组表达质粒的构建36
• 3.1.14重组表达质粒转化E.coli Trans T136
• 3.1.15重组表达质粒的提取36-37
• 3.1.16重组表达质粒的PCR鉴定37
• 3.1.17重组表达质粒的双酶切鉴定37
• 3.1.18重组表达质粒的测序鉴定37
• 3.1.19重组表达质粒转化BL21（DE3）plysS37
• 3.1.20重组表达质粒的提取与鉴定37
• 3.2 结果与分析37-41
• 3.2.1 基因片段p1、p2、p3的扩增37-38
• 3.2.2 重组克隆质粒的PCR鉴定38-39
• 3.2.3 重组克隆质粒的双酶切鉴定39
• 3.2.4 重组克隆质粒的测序鉴定39-40
• 3.2.5 重组表达质粒的PCR鉴定40
• 3.2.6 重组表达质粒的双酶切鉴定40-41
• 3.2.7 重组表达质粒的测序鉴定41
• 3.3 讨论41-43
• 第四章 致病性坏死梭杆菌 120 ku血凝素相关外膜蛋白的原核表达及纯化43-54
• 4.1 材料与方法43-45
• 4.1.1 主要试剂43
• 4.1.2 主要仪器43
• 4.1.3 重组原核表达质粒在大肠杆菌中最适表达条件的筛选43
• 4.1.4 SDS-PAGE分析43-44
• 4.1.5 P1、P2、P3的大量表达44
• 4.1.6 P1、P2、P3的分离纯化44-45
• 4.1.7 Western blot分析45
• 4.2 结果与分析45-52
• 4.2.1 重组原核表达质粒在大肠杆菌中最适表达条件的摸索45-51
• 4.2.2 纯化产物P1、P2、P3的SDS-PAGE分析51-52
• 4.2.3 Western blot分析52
• 4.3 讨论52-54
• 第五章 致病性坏死梭杆菌重组 120 ku血凝素相关外膜蛋白的兔体免疫试验54-56
• 5.1 材料与方法54-55
• 5.1.1 主要试剂及实验动物54
• 5.1.2 主要仪器54
• 5.1.3 抗原的制备54
• 5.1.4 动物分组及免疫程序54
• 5.1.5 兔血清的抗体检测54-55
• 5.2 结果与分析55
• 5.2.1 兔血清的抗体检测55
• 5.3 讨论55-56
• 第六章 全文结论56-57
• 参考文献57-63
• 致谢63-64
• 附录64-77
• 作者简历77

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1 王宏俊;张培君;龚玉梅;杨汉春;;B型副鸡嗜血杆菌血凝素基因的克隆表达及生物活性鉴定[J];畜牧兽医学报;2007年01期

2 ;科技动态[J];中国家禽;2006年24期

3 章银梅,杨月琴,朱小荣,汤懋z，

本文编号：736637