龙眼体胚发生过程中与ARF相关小分子RNA的功能研究

发布时间：2017-09-01 19:04

  本文关键词：龙眼体胚发生过程中与ARF相关小分子RNA的功能研究

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【摘要】：植物生长素通过调控干细胞的再生而诱导体细胞胚胎发生。同时,位于生长素信号转导中心的生长素响应因子受小分子RNA的调控。本研究以龙眼体细胞胚胎发生过程中不同发育阶段的胚性培养物为试验材料,通过RT-PCR和RACE技术克隆小分子RNA及其靶基因生长素响应基因子ARFs,并对其进行生物信息学分析；在此基础上,采用RLM-RACE法鉴定靶基因TAS3、ARF3、ARF4、ARF6、 ARF8、ARF10、ARF16、ARF17的裂解位点；通过实时荧光定量技术检测龙眼体胚发生过程中小分子RNA及其靶基因ARFs的表达情况并对其调控机制做进一步分析。为验证miR39、TAS3和ARFs三者之间的互作关系,进一步通过遗传转化将龙眼TAS3基因在Micro-Tom番茄中过表达,观察再生植株的表型变化并检测miR390、ARF3和ARF4在转基因番茄中的表达情况。本研究主要结果如下：1龙眼体胚miR160、miR167、miR390与TAS3初级体克隆及生物信息学分析以龙眼“红核子”不同胚性培养物为材料,采用RT-PCR技术法克隆获得了龙眼miR160、miR167、miR390、TAS3初级体序列,分别命名为dlo-pri-miR160、 dlo-pri-miR167、dlo-pri-miR390、dlo-pri-TAS3,其大小分别为441 bp、185 bp、 785 bp、579 bp。生物信息学分析表明,dlo-pri-miR 160、 dlo-pri-miR 167、 dlo-pri-miR390、dlo-pri-TAS3均含有典型的二级结构,且自由能比一般植物的平均自由能都较高；系统发育树显示,龙眼miR160、miR167、TAS3初级体分别与番茄(Solanum lycopersicum)、柑桔(Citrus sinensis)、番茄(Solanum lycopersicum)的亲缘关系较近,龙眼miR390与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、葡萄(Vitis vinifera)、大豆(Glycine max)等其他物种的亲缘关系都较远。2龙眼胚性愈伤组织靶基因ARFs的克隆及生物信息学分析以龙眼“红核子”胚性愈伤组织为材料,通过RT-PCR结合RACE法对sRNA调控的靶基因生长素响应基因家族成员进行克隆。成功获得ARF3 (KJ200347.1)、 ARF4 (KJ461667.1)、ARF6 (KJ410230)、ARF8 (KJ410232)、ARF10 (KJ410234)、 ARF16 (KJ410235)、ARF17 (KJ410236) cDNA序列,其大小分别为2561 bp、2698 bp、3381 bp、2868 bp、2093 bp、2279 bp、2098 bp。生物信息学分析表明：在龙眼生长素响应蛋白中,D1ARF3、D1ARF6、D1ARF8、DIARF10、D1ARF16和D1ARF17都属于水溶性蛋白；其中D1ARF6蛋白、D1ARF8蛋白、DIARF10蛋白、D1ARF16蛋白都具有B3-DNA结合区、ARF家族的保守区Auxin_resp和IAA-ARF-dimerisation3种结构域,而D1ARF3蛋白和DIARF17蛋白只具有B3-DNA结合区和ARF家族的保守区Auxin.rresp两种结构域；龙眼生长素响应蛋白ARF6、ARF8中间区域富含谷氨酰胺、丝氨酸和亮氨酸,龙眼生长素响应蛋白ARF3、ARF10、ARF16、ARF17中间非保守区域都不富含谷氨酸(Glu),都具有抑制转录活性；同源性分析表明,龙眼生长素响应基因家族成员都分别与拟南芥生长素响应基因家族成员有很接近的亲缘关系。3龙眼生长素响应因子ARFs及TAS3基因的裂解位点验证为进一步验证龙眼体胚中sRNA与ARFs的调控关系,以龙眼“红核子”松散型胚性愈伤组织、球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚5个不同发育阶段胚性培养物的混样cDNA为模板,采用改良的RLM-RACE法验证靶基因的裂解位点。经测序结果分析,发现miR390靶标的TAS3前体在TTA/TCC位点被切割;而TAS3识别ARF3和ARF4的第二个切割位点,分别为GCA/AGG、CAA/GTT;在ARF6所挑取的18个单克隆子中所裂解的位置都位于龙眼miR167识别位点以外的序列中；而ARF8所挑取的25个单克隆子中只有GCU/GGC这个切割位点位于miR167识别位点序列中；分别挑取miR160的靶基因生长素响应因子ARF10、ARF16、ARF17单克隆子,经分析发现它们有共同的裂解位点为AGG/GAG.4龙眼体胚发生过程中小分子RNA及其靶基因ARFs的定量表达分析采用qPCR技术,分别以龙眼“红核子”品种体胚不同发育阶段培养物、龙眼“四季蜜”品种不同组织器官、2,4-D处理下的龙眼胚性愈伤组织为材料,检测龙眼体胚miR16、miR167、miR390与TAS3初级体及其靶基因ARFs的mRNA转录表达情况。结果表明：在龙眼体胚发育的5个不同阶段中,miR160初级体在球形胚时期的转录水平远远高于其靶基因ARF10、ARF16、ARF17的转录水平,这可能与miR160参与球形胚的形态建成以及对靶基因的负调控有关；但检测不到龙眼miR167初级体的表达信号,其靶基因ARF6与ARF8的表达变化趋势完全相反；龙眼pri-miR390与TAS3初级体在球形胚时期的表达差异较显著；而TAS3初级体与其靶基因ARF4的表达模式较接近的,ARF3的整体转录水平波动较平稳且表达量较低。在龙眼“四季蜜”中,dlo-pri-miR160及其靶基因表达差异较显著的组织器官是种子、根；龙眼pri-miR390、pri-TAS3、ARF3、ARF4在9个组织器官中都有表达,且都在根部中有最高的表达量；虽然检测不到龙眼miR167初级体的表达信号,但其靶基因生长素响应因子ARF6、ARF8在花蕾、根中都有较高的转录水平。在2,4-D处理下的龙眼胚性愈伤组织中,ARF10的表达量明显较高且整体转录水平呈上升的趋势,dlo-pri-miR160与ARF16、ARF17的表达量较低且差异并不显著；dlo-pri-miR167依然没有表达信号,其靶基因ARF6、ARF8随着生长素浓度的增加而升高,两者在0.5 mg/L时的表达差异较显著；dlo-pri-miR390的整体转录水平略低且变化平稳,TAS3初级体在1.0 mg/L、2.0mg/L时的转录水平较高,其靶基因ARF3、ARF4在1.0 mg/L处的表达量最高,同时在2.0 mg/L时表达骤然降低。5龙眼TAS3基因转化Micro-Tom番茄及功能验证本试验利用酶切连接法将TAS3基因片段构建到植物表达载体pCAMBIA-1301上,并将其转化到农杆菌EHA105的感受态细胞中,进行Micro-Tom番茄的遗传转化。为验证转化结果对其进行PCR检测,试验结果显示,龙眼TAS3基因已成功转入到Micro-Tom番茄中；与对照组的普通Micro-Tom番茄相比,所获得转基因番茄植株的表型存在明显差异,主要表现在植株叶片的异常卷曲以及茎干和根部的粗壮。利用qPCR技术检测miR390、ARF3和ARF4在转基因番茄植株中的表达情况,结果表明：生长素响应基因ARF3、ARF4在转基因番茄中的表达水平都明显低于对照水平,推测转基因番茄植株中因TAS3基因的过量表达而强烈抑制了生长素响应因子的表达,与预期结果一致。此外,本研究也发现龙眼TAS3基因对植物的根、茎、叶的生长发育有着重要的影响。综上所述,龙眼小分子RNA准确地裂解其靶基因生长素响应因子而影响体胚的生长发育,即龙眼miR160负调控ARF10、ARF16、ARF17, miR167负调控ARF6、ARF8, miR390负调控TAS3, TAS3负调控ARF3、ARF4。除龙眼miR167初级体检测不到信号表达外,龙眼小分子RNA及其靶基因在龙眼“四季蜜”的花蕾、成花、叶片、小果、大果、果肉、果皮、种子和根9个不同组织器官中都有表达,且都在根部中有较高的转录水平。经PCR试验鉴定,在micro-Tom番茄中过表达龙眼TAS3基因并成功获得转基因植株,其根、茎、叶都发生明显的变化。因此,在龙眼体细胞胚胎发生过程中,小分子RNA与其靶基因生长素响应因子共同构成一个网络调控而影响植物的生长发育。
【关键词】：龙眼 体胚发生 小分子RNA ARF基因 功能验证
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S667.2
【目录】：

• 缩写词9-10
• 摘要10-14
• Abstract14-18
• 第一章 引言18-26
• 1 植物小分子RNA研究进展18-21
• 1.1 植物miRNA及其生物学功能18-20
• 1.2 植物体胚发生过程中miRNA的研究进展20
• 1.3 植物ta-siRNA及其生物学功能20-21
• 2 植物生长素响应基因家族研究进展21-22
• 2.1 植物生长素响应因子的特征21-22
• 2.2 植物生长素响应基因克隆与表达研究22
• 3 植物miRNA及TAS3与其靶基因生长素响应因子的功能研究22-24
• 3.1 植物miR160、miR167、miR390、TAS3及其靶基因生长素响应因子的互作机制22-23
• 3.2 Micro-Tom番茄遗传转化研究进展23-24
• 4 本研究的意义和主要内容24-26
• 4.1 本项目研究的意义24-25
• 4.2 本项目的研究内容25-26
• 第二章 龙眼体胚miR160、miR167、miR390与TAS3初级体克隆及生物信息学分析26-42
• 第一节 龙眼体胚miR160、miR167、miR390与TAS3初级体克隆26-31
• 1 材料与方法26-29
• 1.1 材料26
• 1.2 方法26-29
• 1.2.1 龙眼体胚不同发育时期的培养材料总RNA提取及cDNA合成26-27
• 1.2.2 龙眼体胚pri-miR160、pri-miR167、pri-miR390与pri-TAS3克隆的引物设计及PCR扩增27-29
• 1.2.3 目的基因克隆的PCR反应体系及扩增程序29
• 1.2.4 目的片段的回收、克隆和测序29
• 2 结果与分析29-30
• 2.1 龙眼体胚miR160、miR167、miR390与TAS3基因初级体保守序列的扩增29-30
• 2.2 龙眼体胚miR160、miR167、miR390与TAS3基因初级体cDNA末端的RACE扩增30
• 3 讨论30-31
• 3.1 龙眼体胚miR160、miR167、miR390、TAS3初级体序列克隆存在的问题及意义30-31
• 第二节 龙眼胚性愈伤组织pri-miR160、pri-miR167、pri-miR390与pri-TAS3生物信息学分析31-42
• 1 材料与方法31-32
• 1.1 材料31
• 1.2 方法31-32
• 2 结果与分析32-41
• 2.1 龙眼体胚pri-miR160、pri-miR167、pri-miR390与pri-TAS3二级结构及成熟序列的预测与分析32-38
• 2.1.1 龙眼体胚pri-miR160二级结构及成熟序列的预测与分析32-34
• 2.1.2 龙眼体胚pri-miR167二级结构及成熟序列的预测与分析34-35
• 2.1.3 龙眼体胚pri-miR390二级结构及成熟序列的预测与分析35-36
• 2.1.4 龙眼体胚pri-TAS3二级结构及成熟序列的预测与分析36-38
• 2.2 龙眼体胚pri-miR160、pri-miR167、pri-miR390与pri-TAS3的同源性分析38-41
• 2.2.1 龙眼体胚pri-miR160的同源性分析38
• 2.2.2 龙眼体胚pri-miR167的同源性分析38-39
• 2.2.3 龙眼体胚pri-miR390的同源性分析39-40
• 2.2.4 龙眼体胚pri-TAS3的同源性分析40-41
• 3 讨论41-42
• 第三章 龙眼胚性愈伤组织靶基因ARFs的克隆及生物信息学分析42-53
• 第一节 龙眼胚性愈伤组织靶基因ARFs的克隆42-46
• 1 材料与方法42-44
• 1.1 材料42
• 1.2 方法42-44
• 1.2.1 龙眼胚性愈伤组织、球形胚和鱼雷形胚总RNA提取和cDNA的合成42
• 1.2.2 龙眼胚性愈伤组织ARFs基因的引物设计及PCR扩增42-43
• 1.2.3 龙眼胚性愈伤组织ARF基因家族PCR扩增反应体系和程序43-44
• 1.2.4 目的片段的回收、克隆和测序44
• 2 结果与分析44-46
• 2.1 龙眼胚性愈伤组织ARFs基因保守区序列的获得44
• 2.2 龙眼生长素响应因子ARFs基因cDNA末端的RACE扩增44-45
• 2.3 龙眼生长素响应因子ARFs基因的核苷酸序列分析45-46
• 第二节 龙眼生长素响应因子ARF3、ARF4、ARF6、ARF8、ARF10、ARF16和ARF17的生物信息学分析46-53
• 1 材料与方法46
• 1.1 材料46
• 1.2 方法46
• 2 结果与分析46-51
• 2.1 龙眼胚性愈伤组织生长素响应蛋白ARFs理化性质与保守结构域的预测与分析46-47
• 2.2 龙眼胚性愈伤组织生长素响应蛋白ARFs磷酸化位点的预测与分析47-48
• 2.3 龙眼胚性愈伤组织生长素响应蛋白ARFs二级及三维结构的预测与分析48-49
• 2.4 龙眼胚性愈伤组织生长素响应蛋白ARFs的亚细胞定位和信号肽预测分析49
• 2.5 龙眼胚性愈伤组织ARFs蛋白质的跨膜结构预测与分析49-50
• 2.6 龙眼胚性愈伤组织生长素响应蛋白ARF3、ARF6、ARF8、ARF10、ARF16和ARF17与拟南芥ARF蛋白家族的的系统进化树分析50-51
• 3 讨论51-53
• 第四章 龙眼生长素响应因子ARFs及TAS3基因的裂解位点验证53-59
• 1 材料与方法53-54
• 1.1 材料53
• 1.2 方法53-54
• 2 结果与分析54-57
• 2.1 龙眼TAS3基因及其靶基因ARF3、ARF4的裂解位点验证54-55
• 2.2 龙眼miR167靶基因ARF6、ARF8的裂解位点验证55-56
• 2.3 龙眼miR160靶基因ARF10、ARF16、ARF17的裂解位点验证56-57
• 3 讨论57-59
• 第五章 龙眼体胚发生过程中小分子RNA及其靶基因ARFs的定量表达分析59-76
• 1 材料与方法59-61
• 1.1 材料59-60
• 1.2 方法60-61
• 1.2.1 不同浓度2,4-D处理龙眼胚性愈伤组织60
• 1.2.2 总RNA的提取和cDNA的合成60
• 1.2.3 实时荧光定量PCR60-61
• 2 结果与分析61-72
• 2.1 龙眼体胚发生过程中小分子RNA及其靶基因ARFs在龙眼体细胞胚胎不同发育阶段的qPCR分析61-65
• 2.1.1 龙眼TAS3基因及其靶基因ARF3、ARF4在龙眼体细胞胚胎不同发育阶段的表达分析62
• 2.1.2 龙眼miR167初级体及其靶基因ARF6、ARF8在龙眼体细胞胚胎不同发育阶段的表达分析62-63
• 2.1.3 龙眼miR160初级体及其靶基因ARF1O、ARF16、ARF17在龙眼体细胞胚胎不同发育阶段的表达分析63-64
• 2.1.4 龙眼miR390初级体及其靶基因TAS3在龙眼体细胞胚胎不同发育阶段的表达分析64-65
• 2.2 龙眼小分子RNA及其靶基因ARFs在龙眼“四季蜜”不同组织部位的qPCR分析65-69
• 2.2.1 龙眼TAS3基因及其靶基因ARF3、ARF4在龙眼“四季蜜”不同组织部位的表达分析65-66
• 2.2.2 龙眼miR167初级体及其靶基因ARF6、ARF8在龙眼“四季蜜”不同组织部位的表达分析66-67
• 2.2.3 龙眼miR160初级体及其靶基因ARF10、ARF16、ARF17在龙眼“四季蜜”不同组织部位的表达分析67-68
• 2.2.4 龙眼miR390初级体及其靶基因TAS3在龙眼“四季蜜”不同组织部位的表达分析68-69
• 2.3 龙眼小分子RNA及其靶基因ARFs在2,4-D处理下龙眼胚性愈伤组织中的qPCR分析69-72
• 2.3.1 龙眼TAS3基因及其靶基因ARF3、ARF4在2,4-D处理下龙眼胚性愈伤组织中的表达分析69
• 2.3.2 龙眼miR167初级体及其靶基因ARF6、ARF8在2,4-D处理下龙眼胚性愈伤组织中的表达分析69-70
• 2.3.3 龙眼miR1 60初级体及其靶基因ARF10、ARF16、ARF17在2,4-D处理下龙眼胚性愈伤组织中的表达分析70-71
• 2.3.4 龙眼miR390初级体及其靶基因TAS3在2,4-D处理下龙眼胚性愈伤组织中的表达分析71-72
• 3 讨论72-76
• 3.1 龙眼miR160、miR167、miR390、TAS3初级体及其靶基因ARFs的互作机制介导龙眼体胚的发生72-73
• 3.2 龙眼miR160、miR167、miR390、TAS3初级体及其靶基因ARFs在龙眼“四季蜜”不同组织的特异性表达73-74
• 3.3 不同浓度2,4-D处理下龙眼miR160、miR167、miR390、TAS3初级体及其靶基因ARFs的表达差异74-76
• 第六章 龙眼TAS3基因转化Micro-Tom番茄的研究76-85
• 1 材料与方法76-78
• 1.1 材料76-77
• 1.1.1 试验材料76
• 1.1.2 培养基组分76
• 1.1.3 试验试剂76-77
• 1.2 方法77-78
• 1.2.1 龙眼TAS3基因超表达载体的构建77
• 1.2.2 农杆菌介导的龙眼TAS3表达载体的转化77
• 1.2.3 根癌农杆菌转化番茄子叶77-78
• 1.2.4 转基因植株的检测78
• 1.2.5 检测TAS3、miR390、ARF3和ARF4在转基因番茄中的表达情况78
• 2 结果与分析78-83
• 2.1 构建植物表达载体及重组质粒的鉴定78-79
• 2.2 检测转基因植株79-80
• 2.3 T_0代转基因植物的表型80-81
• 2.4 转基因番茄定量表达分析81-83
• 2.4.1 检测分析TAS3、miR390在转基因番茄中的表达情况81-82
• 2.4.2 检测分析ARF3在转基因番茄中的表达情况82
• 2.4.3 检测分析ARF4在转基因番茄中的表达情况82-83
• 3 讨论83-85
• 3.1 过表达龙眼TAS3基因影响植物根部、茎干及叶片的生长83
• 3.2 龙眼TAS3、miR390和ARFs三者之间的互作机制研究83-85
• 第七章 小结85-90
• 1 龙眼体胚miR160、miR167、miR390与TAS3初级体克隆及生物信息学分析85
• 2 龙眼胚性愈伤组织靶基因ARF3、ARF4、ARF6、ARF8、ARF10、ARF16、ARF17的克隆及生物信息学分析85-86
• 3 龙眼TAS3、ARF3、ARF4、ARF6、ARF8、ARF1O、ARF16、ARF17的裂解位点验证86-87
• 4 龙眼体胚miR160、miR167、miR390与TAS3初级体及其靶基因ARFs的定量表达分析87
• 5 龙眼TAS3基因超表达研究及其与miR390、ARFs三者间的互作机制研究87-90
• 参考文献90-96
• 附录96-110
• 附录1 GenBank上登录的龙眼miR160、miR167、miR390与TAS3初级体及其靶基因的序列信息(12条)96-109
• 附录2 转基因植株表型图109-110
• 在学硕士期间发表学术论文情况110-111
• 一、在学期间发表论文110
• 二、在学期间参加的学术会议110-111
• 致谢111

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