一株Cobetia sp.引起的坛紫菜绿烂病病原菌的鉴定及全基因组测序

发布时间：2017-09-05 21:32

  本文关键词：一株Cobetia sp.引起的坛紫菜绿烂病病原菌的鉴定及全基因组测序

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【摘要】：坛紫菜(Pyropia haitanensis)是中国独有的紫菜品种,在沿海的潮间带区域生活,具有独有的适应环境胁迫体系。近年来,紫菜养殖业的栽培规模持续增长,紫菜已成为重要的经济藻类,同时也遭受着各种各样的病害威胁。本文对引起坛紫菜绿烂病的一株贝特氏菌(Cobetia sp.) X1进行了分离鉴定和致病性研究,将X1鉴定为新种—紫菜贝特氏菌Cobetia pyropiae sp.nov.,并进行了X1的全基因组测序,为紫菜病害流行病学及疾病防治提供了基础数据。1.紫菜绿烂病病原分离鉴定和致病性研究：从福建省莆田养殖海区患绿烂病坛紫菜叶状体分离得到一株优势细菌X 1,人工回接感染实验和组织病理检测显示该菌株能感染坛紫菜,引起绿烂病。X1为革兰氏阴性菌,大小为0.9-1.5μm ×0.4μm,根据16SrRNA基因序列分析结果将X1鉴定为贝特氏菌(Cobetia sp.)。以浓度为104～108cfu/ml 的X1菌悬液感染坛紫菜,在7天内引起紫菜出现13.8%-100%的病斑面积,感染浓度越高,病程的发展越快。2.紫菜贝特氏菌X1的鉴定：X1能在温度4℃-37。C、盐度5-20%、pH 6-10范围内生长,最适生长温度为32℃、最适生长盐度为10%、最适pH为7.5-8.5；X1在明胶酶、淀粉酶、酪蛋白酶、fween 40、Tween 80反应为阴性,Tween20阳性；对18种常见抗生素敏感。在脂酶、α-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、p-半乳糖苷酶的反应呈阳性：主要脂肪酸含量为：C16：1 w7c/16：1w6c(32.92%), C16:0 (19.18%), C12:03-OH (16.04%), C18:1 w7c/18:1 w6c(9.83%), C12:0(8.18%), C17:0 cyclo(7.86%)。上述特征与贝特氏菌属的其他细菌有较明显的不同。在16SrRNA上X1与C. marina较接近,生理生化特征上有较多的差异,且两者DNA杂交结果为33.78%,因此X1可鉴定为新种,定名为紫菜贝特氏菌Cobetia pyropiae sp. nov.3.紫菜贝特氏菌X1的全基因组测序：本研究利用三代测序平台进行了X1菌株的全基因组序列测定。得到一个完整的环形基因组图,基因组大小为3.88M,C+G含量为62.35%,注释的CDS个数为3,431,平均长度为986 bp,含有7个16s-23s-5s rRNA和72个tRNA,进行了COG、KEGG和VFDB分析,结果表明注释的大部分基因与细菌的代谢途径过程相关,包括糖脂转运与代谢、氨基酸转运与代谢、核酸和酶的转运与代谢等;8%的基因为毒力相关因子,包括鞭毛、菌毛、胞外多糖、转运系统和分泌系统等。
【关键词】：坛紫菜 绿烂病 贝特氏菌 致病性 鉴定 全基因组测序
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S946.21
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 前言13-25
• 1 紫菜的生物学特性13-14
• 1.1 紫菜的分类及价值13
• 1.2 紫菜的栽培养殖13-14
• 2 藻际微环境14-15
• 3 紫菜病害概况介绍15-18
• 3.1 紫菜丝状体和叶状体常见病害15
• 3.2 国内外有关紫菜病害微生物学的研究进展15-17
• 3.2.1 国外紫菜病害研究进展16
• 3.2.2 国内紫菜病害研究进展16-17
• 3.3 贝特氏菌属研究概述17-18
• 4 海洋新菌的分类鉴定18-20
• 4.1 基于遗传学的分类鉴定18-19
• 4.2 表型特征鉴定19-20
• 5 微生物基因组研究概况及内容20-24
• 5.1 基因组测序技术21-22
• 5.2 生物信息学22
• 5.3 微生物基因组研究意义22-24
• 6 本论文研究的目的和意义24-25
• 第一章 坛紫菜病原菌的分离及组织病理观察25-38
• 1 材料与方法25-27
• 1.1 发病坛紫菜和健康坛紫菜来源25
• 1.2 病原菌的分离25
• 1.3 病原菌感染紫菜叶状体实验25-26
• 1.3.1 制定菌液标准曲线25-26
• 1.3.2 人工回接感染实验26
• 1.4 病原菌的生理生化和药物敏感分析26
• 1.5 病原菌的16SrRNA基因序列分析26-27
• 1.6 不同病原菌浓度感染紫菜的程度27
• 2 结果27-36
• 2.1 海区坛紫菜患病症状27-28
• 2.2 人工感染实验及组织病理的观察28-31
• 2.3 病原菌的生理生化特征及16SrRNA基因系统发育学分析31-35
• 2.4 不同X1浓度感染坛紫菜的程度35-36
• 3 讨论36-38
• 第二章 坛紫菜绿烂病病原菌X1的系统鉴定38-49
• 1 实验菌株38
• 2 实验方法38-40
• 2.1 基于遗传学的分类鉴定38
• 2.2 表型特征鉴定38-39
• 2.2.1 菌株菌落形态38
• 2.2.2 革兰氏染色38
• 2.2.3 鞭毛染色和透射电镜观察38-39
• 2.3 生理生化鉴定39
• 2.3.1 温度、盐度、pH对细菌生长的影响39
• 2.3.2 胞外酶鉴定试验39
• 2.3.3 唯一碳源利用试验39
• 2.4 实验菌株API快速鉴定系统39-40
• 2.4.1 运用API鉴定系统鉴定细菌39-40
• 2.4.2 API VET鉴定系统进行药敏检测40
• 2.5 化学分类特征40
• 2.6 DNA-DNA杂交40
• 3 实验结果40-48
• 3.1 基于遗传学的分类鉴定结果40-41
• 3.2 表型特征鉴定结果41-47
• 3.2.1 菌落及菌体形态41
• 3.2.2 生理生化特征41-45
• 3.2.3 化学分类特征45-47
• 3.3 DNA杂交结果47-48
• 4 讨论48-49
• 第三章 Cobetia pyropiae sp.nov.全基因组测序及分析49-65
• 1 实验材料与方法49-52
• 1.1 培养条件49
• 1.2 X1基因组DNA的提取及质控检测49-50
• 1.3 X1的全基因组测序50
• 1.4 基因组序列拼接组装和组分分析50
• 1.5 基因的预测及注释50
• 1.6 基因功能分析50-51
• 1.6.1 KEGG代谢途径分析50
• 1.6.2 COG基因家族分类50-51
• 1.7 毒力相关的基因分析51-52
• 2 结果分析52-64
• 2.1 基因组测序提取与质控检测52-53
• 2.2 基因组序列的拼接、组装和注释分析53-55
• 2.3 基因功能分类55-56
• 2.4 基因功能分析56-64
• 2.4.1 Ⅰ型分泌系统(Type Ⅰ secretion system)56-60
• 2.4.2 胞外多糖60
• 2.4.3 胞外酶产物60
• 2.4.4 菌毛和鞭毛60-61
• 2.4.5 与环境相适应的基因61-64
• 3 讨论64-65
• 参考文献65-73
• 附录73-74
• 致谢74
• 个人简历74-75
• 附件75-94

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本文编号：800231