视黄醇对仔猪睾丸支持细胞体外生物学特性的影响

发布时间：2017-09-11 22:46

  本文关键词：视黄醇对仔猪睾丸支持细胞体外生物学特性的影响

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【摘要】：视黄醇及其代谢产物是雄性动物睾丸发育和精子发生所必需的物质。支持细胞是睾丸内视黄醇作用的靶细胞,为生精细胞发育和成熟提供特有的微环境。本试验以分离自3-5周龄仔猪睾丸的支持细胞为材料,采用RT-PCR、CCK-8、ELISA检测支持细胞内增殖和凋亡相关基因、细胞因子的表达,分析视黄醇对仔猪睾丸支持细胞增殖、凋亡和表达细胞因子的影响,获得如下结果：1仔猪支持细胞的分离培养和鉴定经比较3组酶消化法所获得细胞数量、细胞活率和GATA-4 mRNA相对表达量,结果显示,先以0.25%胶原酶IV和0.1%透明质酸酶,37°C消化60 min,再以0.25%胰酶和0.1%DNase I,37°C消化20 min,有利于支持细胞的富集。于贴壁不同时间收集细胞,分析悬浮细胞和贴壁细胞中GATA-4 mRNA相对表达量,结果显示,支持细胞在2h内不贴壁,贴壁时间主要分布在3-5 h。采用差异贴壁和低渗处理后纯化细胞,形态不规则,胞体宽大,细胞核呈卵圆或不规则形；GATA4染色呈阳性,碱性磷酸酶染色呈阴性；RT-PCR检测结果显示,纯化后细胞表达支持细胞标记GATA4、 SOX9、INHB,不表达间质细胞标记CYP17、3β-HSD和管周细胞标记α-SMA,符合支持细胞的蓦本特征；经ELISA检测显示,本试验所分离支持细胞表达GDNF、LIF、 CSF-1、FGF2、EGF,而SCF未检出。2视黄醇对支持细胞增殖和凋亡的影响分别在培养基中添加0.005 μmol/L、0.025 μmol/L、0.125 μmol/L、0.625μmol/L、 1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L和10μmol/L视黄醇,短期培养(24 h)和长期培养(3d)后,经CCK-8检测支持细胞活性,结果如下：培养24h,视黄醇浓度低于5μmol/L,对支持细胞的活性没有显著影响,而浓度达到5μmol/L显著抑制支持细胞活性,表明5μmol/L及以上浓度的视黄醇对支持细胞具有显著的细胞毒性效应；培养3d,视黄醇浓度低于为0.005μmol/L和0.025μmol/L时对支持细胞活性无显著影响,视黄醇浓度为0.125μmol/L和0.625μmol/L时显著抑制支持细胞活性(P0.05),浓度达到1.25μmol/L时表现极显著抑制(P0.01)。短期培养和长期培养结果显示,视黄醇的作用具有时效性和剂量依赖性。实验选取1.25 μmol/L作为视黄醇的试验浓度,应用RT-PCR检测分析视黄醇对细胞增殖(PCNA、C-MYC和BCL-2)和凋亡相关基因(CASP3和BAX)表达的影响,结果显示：视黄醇组增殖相关基因的表达量显著低于对照组,凋亡相关基因的表达量显著高于对照组。结果表明视黄醇通过抑制支持细胞内增殖相关基因表达,促进凋亡相关基因表达,进而抑制支持细胞增殖。3视黄醇对支持细胞分泌细胞因子的影响在培养基中添加1.25 μmol/L视黄醇,应用RT-PCR分析和ELISA检测分析视黄醇对支持细胞表达细胞因子的影响,RT-PCR分析显示,视黄醇显著抑制支持细胞内GDNF、CSF-1和EGF mRNA表达,对LIF和FGF2 mRNA表达没有显著影响；经ELISA检测,视黄醇显著抑制支持细胞中GDNF、LIF、CSF-1、FGF2、EGF蛋白的表达。综上所述,视黄醇具有抑制支持细胞内增殖相关基因表达,促进凋亡相关基因表达,和抑制支持细胞合成和分泌细胞因子的作用,进而降低支持细胞活性,抑制支持细胞增殖。
【关键词】：猪 睾丸 支持细胞 视黄醇
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S828
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 缩略词表9-12
• 第一章 支持细胞生物学特性以及应用研究和视黄醇对雄性生殖的影响的研究现状12-23
• 1 睾丸支持细胞的生物学特性和研究现状12-19
• 1.1 支持细胞发育12-13
• 1.2 支持细胞的形态和结构特点13-14
• 1.3 支持细胞的功能14-17
• 1.4 支持细胞的分离鉴定17-18
• 1.5 支持细胞的应用探索18-19
• 2 视黄醇及其代谢产物在雄性生殖中的作用19-22
• 2.1 视黄酸与雄性生殖19-22
• 2.2 视黄醇对支持细胞的影响的研究现状22
• 3 研究的目的意义22-23
• 第二章 仔猪睾丸支持细胞分离、纯化和鉴定23-38
• 1 材料23-24
• 1.1 试验材料23
• 1.2 主要试剂23
• 1.3 主要试剂配制23-24
• 2 方法24-29
• 2.1 分离24-25
• 2.2 支持细胞贴壁性质分析和纯化25
• 2.3 鉴定25-26
• 2.4 RT-PCR26-27
• 2.5 支持细胞的传代和生长曲线绘制27-28
• 2.6 ELISA检测部分细胞因子的表达28
• 2.7 支持细胞的冻存和复苏28-29
• 2.8 数据统计29
• 3 结果29-35
• 3.1 不同消化方法的分离效率比较29-30
• 3.2 支持细胞贴壁性质分析和纯化30-31
• 3.3 持细胞的鉴定31-32
• 3.4 支持细胞的传代培养和生长去曲线绘制32-34
• 3.5 ELISA检测分析细胞因子的表达34-35
• 3.6 支持细胞的冻存和复苏35
• 4 讨论35-37
• 5 小结37-38
• 第三章 视黄醇对支持睾丸支持细胞体外生物学特性的影响38-50
• 1 材料38-39
• 1.1 试验材料38
• 1.2 主要试剂38-39
• 2 方法39-42
• 2.1 视黄醇对支持细胞增殖的影响39-41
• 2.2 视黄醇对支持细胞分泌细胞因子的影响41
• 2.3 数据统计41-42
• 3. 结果42-47
• 3.1 视黄醇作用浓度分析42-43
• 3.2 视黄醇对支持细胞增殖的影响43-44
• 3.3 视黄醇对支持细胞表达细胞因子的影响44-47
• 4 讨论47-48
• 5 小结48-50
• 结论50-51
• 参考文献51-62
• 致谢62-63
• 硕士期间发表论文63

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