PRRSV衣壳蛋白GP5-M腺病毒载体的构建及其在山羊乳腺中的表达研究

发布时间：2017-09-12 17:52

  本文关键词：PRRSV衣壳蛋白GP5-M腺病毒载体的构建及其在山羊乳腺中的表达研究

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【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的感染对于猪的免疫系统是一把双刃剑:一方面PRRSV能够偏好性的吸附免疫细胞,正是由于PRRSV特异性的结合免疫细胞系,特别是巨噬细胞,一旦PRRSV广泛的复制就会导致免疫的抑制,导致继发感染,由此会引发多种传染病疫苗的免疫失败。另一方面病毒感染后刺激了机体的免疫系统,产生了免疫力,保护了动物机体免受二次感染。当前PRRSV疫苗不是令人满意的效果和安全性促使人们不断努力的去研究新一代疫苗。在PRRS(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)的防制中,国内外相关专家的研究报道均认为开发有效预防PRRS疫苗的着力点在于核酸疫苗。GP5和M蛋白因其特异的抗原特点,成为当前研究核酸疫苗的明星蛋白。有研究发现利用重组载体表达融合的GP5和M蛋白能够产生了比两者单独免疫更好地免疫效果。融合表达的GP5和M蛋白成为研发更高效预防PRRSV疫苗的新方向。当前重组腺病毒在运送疫苗抗原上成为最高效的载体系统之一。腺病毒载体已被广泛应用于人类基因治疗,研制人类和各种动物基因工程疫苗。乳腺已被确定为生产真核修饰重组蛋白的有吸引力的选择。在乳腺上皮细胞中合成的异源蛋白会立即分泌到乳汁中,而且这些蛋白可以使用相对简单的层析系统进行纯化。我们利用双启动子的腺病毒过表达系统选择了PRRSV的结构蛋白M与GP5串联融合表达,从而更好地发挥PRRSV M、GP5蛋白的特异抗原活性以及协同作用,并初步验证其在山羊乳腺上皮细胞和乳汁中的表达,为PRRSV的基因工程疫苗的研究开辟新的途径。本实验的主要研究内容和结果如下:(1)成功克隆了1221bp的PRRSV衣壳蛋白GP5和M蛋白融合连接并在N端加有信号肽、HIS标签的CDS区,构建了PRRSV表达加有信号肽HIS标签融合表达的GP5和M蛋白的重组腺病毒载体pBHG-SignalP-His-GP5-M,RT-PCR验证了载体构建成功。(2)采用两步法细菌内同源重组,成功包装出了腺病毒rHAd-SignalP-His-GP5-M,并扩增了该病毒测得其滴度为1011TU/ml。(3)包装的腺病毒rHAd-SignalP-His-GP5-M成功感染了乳腺上皮细胞,并利用Q-PCR检测到病毒感染的乳腺上皮细胞中有高量的GP5-M基因表达。Western blotting检测到乳腺上皮细胞和细胞上清中GP5-M蛋白的表达。(4)山羊乳腺活体灌注包装的腺病毒rHAd-SignalP-His-GP5-M,利用Western blotting从收集的乳汁中检测到高量的GP5-M融合蛋白的表达,这为下一部大量病毒抗原的纯化收集奠定了基础
【关键词】：腺病毒载体 GP5-M蛋白 山羊乳腺表达
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.651
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 文献综述12-28
• 第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究概况12-21
• 1.1 PRRSV的病原学及理化学特性13-15
• 1.1.1 病毒粒子13
• 1.1.2 PRRSV的遗传多样性13
• 1.1.3 PRRSV的基因组13-15
• 1.2 PRRS免疫学研究进展15-16
• 1.3 PRRSV疫苗研究概况16-21
• 1.3.1 PRRSV的减毒活疫苗作为候选疫苗的研究16-17
• 1.3.2 重组载体表达PRRSV的病毒蛋白作为候选疫苗17-19
• 1.3.3 候选的DNA疫苗19-21
• 第二章 重组腺病毒载体疫苗21-24
• 2.1 腺病毒的一般特征21-22
• 2.2 动物重组腺病毒的分类22-23
• 2.3 腺病毒载体在防治PRRSV中的一些应用23-24
• 第三章 乳腺生物反应器24-28
• 3.1 乳腺的特征24-25
• 3.2 乳腺生物反应器的研究25-28
• 实验研究28-57
• 第四章 表达PRRSV GP5-M蛋白腺病毒的包装28-45
• 4.1 实验材料29-32
• 4.1.1 主要耗材、试剂29-30
• 4.1.2 主要实验仪器30-31
• 4.1.3 试验中所用试剂配制31
• 4.1.4 载体和菌株31-32
• 4.2 实验方法32-40
• 4.2.1 腺病毒载体的选择32
• 4.2.2 PRRSV GP5和M基因CDS区的克隆32-35
• 4.2.3 重组腺病毒载体pBHG-SignalP-His-GP5-M的构建与鉴定35-39
• 4.2.4 重组腺病毒的包装与滴度的测定39-40
• 4.3 结果40-43
• 4.3.1 猪蓝耳病毒衣壳蛋白GP5和M基因CDS区的克隆与鉴定40
• 4.3.2 重组腺病毒载体pBHG-SignalP-His-GP5-M的构建与鉴定40-41
• 4.3.3 重组腺病毒的包装与滴度的测定41-43
• 4.4 讨论43-44
• 4.5 小结44-45
• 第五章 GP5-M蛋白在山羊乳腺中的表达研究45-57
• 5.1 实验材料45-47
• 5.1.1 主要耗材、试剂45-46
• 5.1.2 主要仪器46
• 5.1.3 试验中所用试剂配制46-47
• 5.1.4 实验动物47
• 5.2 试验方法47-50
• 5.2.1 乳腺上皮细胞的分离培养47
• 5.2.2 测定重组腺病毒47-48
• 5.2.3 目的基因GP5-M蛋白在乳腺上皮细胞中的表达检测48
• 5.2.4 Western blotting检测GP5-M蛋白在乳腺上皮细胞和细胞上清中的表达 . 375.2.5 腺病毒rHAd-SignalP-His-GP5-M的大量扩增、收集和纯化48-49
• 5.2.5 腺病毒 r HAd-Signal P-His-GP5-M 的大量扩增、收集和纯化49-50
• 5.2.6 His-GP5-M蛋白在奶山羊乳腺中的表达50
• 5.3 结果50-55
• 5.3.1 乳腺上皮细胞的分离纯化和鉴定50
• 5.3.2 测定重组腺病毒50-52
• 5.3.3 目的基因GP5-M在乳腺上皮细胞中的表达检测52
• 5.3.4 Western blotting检测乳腺上皮细胞和细胞上清中GP5-M蛋白的表达52-53
• 5.3.5 腺病毒的大量扩增、纯化与滴度测定53-54
• 5.3.6 His-GP5-M蛋白在奶山羊乳腺中的表达54-55
• 5.4 讨论55-56
• 5.5 小结56-57
• 全文结论57-58
• 参考文献58-70
• 致谢70-71
• 作者简介71

【共引文献】

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2 刘建;汤德元;曾智勇;罗险峰;李春燕;甘振磊;王凤;郝飞;;某规模化猪场猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型混合感染的诊断[J];黑龙江畜牧兽医;2013年19期

3 王洪光;汤德元;罗险峰;曾智勇;甘振磊;刘建;郝飞;;贵州省某猪场PRRSV,PCV-2和PRV混合感染的快速诊断[J];黑龙江畜牧兽医;2013年21期

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本文编号：838672