牛支原体LAMPs诱导EBL细胞IL-1β释放的分子机制研究

发布时间：2017-09-29 02:33

  本文关键词：牛支原体LAMPs诱导EBL细胞IL-1β释放的分子机制研究

  更多相关文章： 牛支原体 脂质相关膜蛋白(LAMPs) 胎牛肺细胞 NF-κB信号通路 IL-1β

【摘要】：牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)感染引起的犊牛肺炎、关节炎、乳房炎、角膜炎等与牛支原体相关的疾病简称为牛支原体相关疾病(Mycoplasma bovis-associated disease,Mb AD)。Mb AD是引起我国养牛场中犊牛死亡的主要疾病之一,但是牛支原体的致病性及致病机制尚不十分清楚。天然免疫应答是脊椎动物对抗入侵的外界微生物的第一道防线。天然免疫细胞主要包括上皮细胞、中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞等。作为宿主天然免疫细胞的重要一员,上皮细胞通过直接清除病原微生物和释放相应的细胞因子和趋化因子来招募其它免疫细胞到感染部位来发挥其免疫学功能。肺脏是牛支原体感染的靶器官,研究肺上皮细胞对抗牛支原体及其重要毒力蛋白的免疫应答,可以帮助我们理解宿主细胞的防御策略和相应的牛支原体的逃避策略。胎牛肺细胞(embryonic bovine lung cell,EBL cell)是用怀胎7个月左右的胎牛肺组织建立的一种原代细胞。该细胞是研究牛的病毒性、细菌性疾病的重要细胞模型。支原体膜表面存在着大量的脂质相关膜蛋白(lipid-associated membrane proteins,LAMPs)。支原体LAMPs是介导支原体粘附宿主、入侵宿主的基础。同时,支原体LAMPs能够与细胞膜表面受体结合,激发宿主细胞因子的释放。在本研究中,以EBL细胞为细胞模型,研究宿主在牛支原体LAMPs刺激下释放IL-1β的分子机制。1.牛天然免疫信号通路关键分子的克隆及其重组质粒的构建克隆牛NF-κB信号通路及上游Toll-like receptor信号通路中关键信号分子TLR1,TLR2,My D88,IRAK4和p65,并构建其重组质粒:p CMV-HA-TLR1;p CMV-HA-TLR2;p CMV-HA-My D88;p CMV-HA-IRAK4和p EGFP-p65等,为后文牛支原体LAMPs诱导EBL细胞IL-1β释放的分子机制研究提供工具。2.牛支原体LAMPs诱导EBL细胞IL-1β释放的分子机制研究以EBL细胞为细胞模型,将一定量的热致死的M.bovis和活的M.bovis分别刺激EBL细胞,应用SYBR Green I Real-time PCR检测EBL细胞IL-1β的表达水平。结果证实,活的M.bovis及热致死的M.bovis均能够诱导EBL细胞IL-1β的产生。另一方面,应用牛支原体LAMPs刺激EBL细胞,发现牛支原体LAMPs也能够诱导EBL细胞IL-1β的产生,且呈时间及剂量依赖。进一步,应用激光共聚焦显微镜和Western Blotting技术,证实,牛支原体LAMPs能够诱导EBL细胞转录因子p65转核从而激活NF-κB信号通路,诱导下游IL-1β的释放,且跨膜受体TLR2在此过程中发挥着重要的作用。
【关键词】：牛支原体 脂质相关膜蛋白(LAMPs) 胎牛肺细胞 NF-κB信号通路 IL-1β
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.62
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 英文缩略表12-13
• 第一章 引言13-19
• 1.1 牛支原体（Mycoplasma bovis）简介13
• 1.2 牛支原体的流行病学13-14
• 1.3 牛支原体的临床症状和病理变化14
• 1.4 牛支原体的鉴别诊断14-15
• 1.4.1 M.bovis的分离培养14-15
• 1.4.2 M.bovis的血清学诊断15
• 1.4.3 M.bovis的分子生物学诊断15
• 1.5 牛支原体相关疾病的防治15-16
• 1.6 牛支原体脂质相关膜蛋白(lipid-associated membrane proteins,LAMPs)诱导宿主免疫应答的研究16-18
• 1.7 本研究的目的和意义18-19
• 第二章 关键信号分子的扩增及其重组质粒的构建19-27
• 2.1 材料19
• 2.1.1 菌株、质粒、细胞及实验动物19
• 2.1.2 主要试剂19
• 2.1.3 主要设备仪器19
• 2.2 方法19-23
• 2.2.1 引物的设计与合成19-20
• 2.2.2 EBL细胞的培养及cDNA的制备20-21
• 2.2.3 目的基因的扩增21
• 2.2.4 重组质粒的构建与鉴定21
• 2.2.5 重组质粒pET-30a-p65（N端 666bp）的转化及诱导表达21-22
• 2.2.6 重组p65（N端 666bp）可溶性判断22
• 2.2.7 重组p65（N端 666bp）的纯化22
• 2.2.8 抗p65（N端 666bp）蛋白小鼠阳性血清的制备22
• 2.2.9 小鼠抗p65（N端 666bp）蛋白阳性血清的Western Blotting验证22-23
• 2.3 结果23-26
• 2.3.1 目的基因的扩增结果23
• 2.3.2 重组质粒的PCR鉴定结果23-24
• 2.3.3 重组质粒的双酶切鉴定结果24
• 2.3.4 序列测定结果24
• 2.3.5 重组p65（N端 666bp）的诱导及可溶性判定24-25
• 2.3.6 重组p65（N端 666bp）的纯化结果25
• 2.3.7 小鼠抗p65（N端 666bp）蛋白的阳性血清的Western Blotting检测25-26
• 2.4 小结26-27
• 第三章 牛支原体的LAMPs诱导EBL细胞IL-1β 释放的分子机制研究27-36
• 3.1 材料27-28
• 3.1.1 菌株、细胞和质粒27
• 3.1.2 主要试剂27
• 3.1.3 主要设备27-28
• 3.2 方法28-30
• 3.2.1 M.bovis的培养及其LAMPs的提取28
• 3.2.2 SYBR Green I实时定量PCR及质粒转染28
• 3.2.3 SYBR Green I Real-time PCR检测M.bovis刺激EBL细胞IL-1β 表达情况28-29
• 3.2.4 SYBR Green I Real-time PCR检测LAMPs刺激EBL细胞IL-1β 释放的最佳时间和最佳剂量29
• 3.2.5 ELISA方法检测LAMPs诱导EBL细胞IL-1β 的释放量29
• 3.2.6 激光共聚焦显微镜检测LAMPs诱导EBL细胞p65转核29
• 3.2.7 Western Blotting检测LAMPs诱导EBL细胞p65转核29-30
• 3.2.8 SYBR Green I Real-time PCR检测NF-κB活性被抑制后LAMPs刺激EBL细胞IL-1β 表达情况30
• 3.2.9 SYBR Green I Real-time PCR检测TLR2对LAMPs刺激的EBL细胞IL-1β 表达水平的影响30
• 3.3 结果30-34
• 3.3.1 SYBR Green I Real-time PCR检测M.bovis刺激EBL细胞IL-1β 表达情况30-31
• 3.3.2 SYBR Green I Real-time PCR检测LAMPs刺激EBL细胞IL-1β 表达的最佳时间和最佳剂量31
• 3.3.3 ELISA方法检测LAMPs诱导EBL细胞IL-1β 的释放量31-32
• 3.3.4 激光共聚焦显微镜检测LAMPs诱导EBL细胞p65转核32-33
• 3.3.5 Western Blotting证明LAMPs能够诱导EBL细胞p65转核33
• 3.3.6 SYBR Green I Real-time PCR证明NF-κB活性被抑制后LAMPs刺激EBL细胞IL-1β 表达下调33-34
• 3.3.7 SYBR Green I Real-time PCR检测TLR2对LAMPs刺激的EBL细胞IL-1β 表达水平的影响34
• 3.4 小结34
• 3.5 讨论34-36
• 第四章 结论36-37
• 参考文献37-43
• 致谢43-44
• 作者简介44

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 陈嘉棣;黎济申;张赋平;赵洪兴;许日龙;张孙渠;;上海乳牛霉形体的分离与鉴定[J];畜牧兽医学报;1983年04期

2 何军;吴移谋;;支原体脂质相关膜蛋白的研究进展[J];中国人兽共患病学报;2008年11期

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 周玉梅;丝状支原体丝状亚种P19蛋白粘附特性的研究[D];中国农业科学院;2014年

，

本文编号：939520