鲈鲤免疫相关基因的克隆及日粮蛋白水平对其表达量的影响

发布时间：2017-10-07 14:15

  本文关键词：鲈鲤免疫相关基因的克隆及日粮蛋白水平对其表达量的影响

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【摘要】：本试验对鲈鲤幼鱼Defensin、Hepcidin、TNF-a和IL-10等4个免疫相关基因完整的编码区序列进行了克隆和分析,并研究不同蛋白水平日粮饲喂鲈鲤幼鱼后,4种免疫基因在各组织中表达模式；另外为筛选稳定内参基因,探讨了常用管家基因EF-1a、B2M, ODC, β-actin和GAPDH基因在同等试验条件下在多种组织表达稳定性。试验结果充实和拓展了鲈鲤营养免疫学研究资料,为鲈鲤健康养殖提供了试验依据。试验采用克隆、测序等基本方法获得相关免疫基因序列。采用单因子方案设计,选择480尾体质健康、平均体重在(15.24±1.1)g鲈鲤幼鱼,随机分为4组,每组3个重复,每个重复40尾,分别饲喂蛋白质水平为37.41%(I)、40.10%(Ⅱ)、44.34%(Ⅲ)、49.20%(Ⅳ)的试验日粮。80d试验期后,每组随机挑选6尾鱼,采集大脑、腮、头肾、脾脏、肝脏、后肠、皮肤和心脏等组织,采用荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测样品中各基因表达量,并用RefFinder和geNorm软件分析内参基因稳定性。结果表明：1.Hepcidin、TNF-a、Defensin、IL-10基因CDS区序列：4种基因全长分别为282、711、204、540bp；分别编码93、236、67、179个氨基酸；信号肽切割位点分别在24～25、50-51、24～25和22-23位间。各基因编码氨基酸进化树与形态分类学地位基本一致,预测的编码蛋白质分子量分别为10.6kDa、26.4kDa, 7.2kDa和20.9kDa；等电点为6.39、5.25、8.22和8.42；Defensin编码蛋白为疏水性蛋白质,其他基因编码蛋白为亲水性蛋白质。2.没有单一稳定的内参基因可以适用于不同蛋白水平日粮饲喂的各组鲈鲤不同组织中的表达分析。通过Reffinder分析可知,EF-1α在不同组织间表达最稳定,最适合做单一内参基因；在不同组间同一组织中最稳定表达基因不同,肝脏和皮肤中为EF-1a,后肠、脾脏、腮、心脏和头肾为B2M,大脑为ODC,这些基因适合在相应组织中做单一内参基因。Genorm分析,所有Vn/Vn+1都小于0.15,说明2个最稳定内参基因足以满足在相应条件下的定量校正。3.4种基因在各组织中均可检测到,除TNF-a外且具有组织特异性。Defensin皮肤中表达量显著高于其他组织(P0.05)；Hepcidin在肝脏中表达最高,其次为脾脏和后肠,不同组织间差异显著(P0.晒)；IL-10在腮中表达显著高于其他各组织(P0.05),其次为脾脏、后肠、头肾等组织；TNF-a在各组织中表达差异不显著(P0.05)。总体表达量来看,IL-10和TNF-a在各组织中表达水平相对较低。4.随着日粮蛋白水平提高,Defensin在大脑、IL-10在腮和后肠表达模式相同,表达水平均呈现先升高后降低趋势,最高表达都出现在Ⅱ组,显著高于其他各组(P0.05),2种基因在其余组织各组间表达差异不显著(P＞0.05)；Hepcdin在大脑、肝脏和脾脏中表达量先增加后降低,均在Ⅲ组达到最高,其余组织各组间表达差异不显著(P0.05)；TNF-a基因除了心脏中有先升高后下降趋势外,其他各组织组间差异不显著(P0.05)。研究结果提示,检测各组不同组织4种基因表达时,可考虑EF-1a作单一内参基因；检测4种基因在同一组织中表达分析时,应选用相应的适宜内参基因,肝脏和皮肤可选EF-1α,后肠、脾脏、腮、心脏和头肾可选B2M,脑可选ODC。日粮中适宜的蛋白添加水平可以促进相关免疫基因的表达,当添加蛋白量为40.10%时,Defensin和IL-10基因组织表达量最高,生长性能最好,添加蛋白量为44.34%时,Hepcdin基因表达最好,若均衡免疫调控,鲈鲤日粮适宜蛋白质水平为40.10%～4.34%。
【关键词】：鲈鲤 蛋白水平 免疫基因 内参基因
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 1 综述10-19
• 1.1 鲈鲤的基本概况10-12
• 1.1.1 鲈鲤的生物学特性10
• 1.1.2 鲈鲤养殖现状10-12
• 1.2 蛋白质对鱼类免疫力的影响12-14
• 1.2.1 日粮蛋白质水平对鱼类免疫力影响12-13
• 1.2.2 日粮氨基酸和多肽水平对鱼类免疫力影响13-14
• 1.3 Defensin、Hepcidin、TNF-α和IL-10基因研究进展14-18
• 1.3.1 Defensin基因研究进展15-16
• 1.3.2 Hepcidin基因研究进展16
• 1.3.3 TNF-α基因研究进展16-17
• 1.3.4 IL-10基因研究进展17-18
• 1.4 内参基因18
• 1.5 选题依据和意义18-19
• 2 材料与方法19-27
• 2.1 试验日粮19-20
• 2.2 试验条件及管理20-21
• 2.3 主要仪器设备21-22
• 2.4 试验试剂22
• 2.5 常用试剂的配制22
• 2.6 试验方法22-26
• 2.6.1 总RNA提取22-23
• 2.6.2 TotalRNA的质检23
• 2.6.3 cDNA合成23-24
• 2.6.4 PCR引物设计24
• 2.6.5 PCR扩增和测序24-25
• 2.6.6 实时荧光定量RT-PCR25-26
• 2.7 数据统计分析26-27
• 3 结果与分析27-44
• 3.1 鲈鲤Hepcidin、TNF-α、Defensin和IL-10基因PCR扩增结果27-28
• 3.2 鲈鲤Hepcidin、TNF-α、Defensin和IL-10基因ORF及其氨基酸序列分析28-29
• 3.3 鲈鲤Hepcidin、TNF-α、Defensin和IL-10氨基酸进化分析29
• 3.4 鲈鲤Hepcidin、TNF-α、Defensin和IL-10基因编码蛋白的理化性质29-33
• 3.5 内参基因评定与筛选33-39
• 3.5.1 不同蛋白水平下鲈鲤各组织中内参基因表达稳定性分析35-37
• 3.5.2 适宜内参基因确定37-39
• 3.6 不同蛋白水平日粮对鲈鲤Hepcidin、TNF-α、Defensin和IL-10基因组织表达39-44
• 4 讨论44-48
• 4.1 鲈鲤Hepcidin、Defensin、IL-10和TNF-α基因序列分析44-45
• 4.2 内参基因表达稳定性分析45-46
• 4.3 鲈鲤Hepcidin、Defensin、IL-10和TNF-α基因表达分析46-48
• 5 结论48-49
• 参考文献49-58
• 致谢58-59
• 附录59-65
• 攻读硕士期间发表论文情况65

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