RNA干扰调控水稻齿矮病毒在介体褐飞虱培养细胞内的持久侵染

发布时间：2017-10-09 05:21

  本文关键词：RNA干扰调控水稻齿矮病毒在介体褐飞虱培养细胞内的持久侵染

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【摘要】：水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus, RRSV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)刺突呼肠孤亚科(Spinareovirinae)水稻病毒属(Oryzavirus)的代表成员,由介体褐飞虱(Nilaparvata lugens)以持久增殖型方式传播,但不经卵传。前期研究利用褐飞虱培养细胞阐释了非结构蛋白Pns6和Pns10参与了病毒的复制,揭示了非结构蛋白Pns7在病毒扩散过程中发挥的作用,也明确了RRSV在褐飞虱体内的侵染循回途径。而在这些过程中,RRSV不仅需要突破昆虫体内的各种组织屏障和膜屏障的阻碍,还需要克服各种抗病毒机制的阻碍,如RNA干扰(RNA interference, RNAi)。RNAi是指由内源或外源双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱导同源mRNA发生降解的一种转录后基因沉默现象,是生物体细胞内有效的抗病毒防御形式,也是生物体用于保护自身基因组免遭外源基因侵害的一种方式。为探索RRSV在其介体褐飞虱体内的复制增殖是否受RNA干扰的调控,本实验首先用RT-qPCR方法分析病毒侵染对RNAi途径抗病毒途径相关基因表达的影响。结果发现RRSV侵染褐飞虱培养细胞,能诱导细胞内RNAi途径抗病毒相关基因Argonaute 1(Agol)、Argonaute 2 (Ago2)、Argonaute3 (Ago3)、Dicer1、 Dicer2、Eri-like-1α(Eri-la)、Eri-like-1b(Eri-1b)、Piwi和(systemic RNA interference defective,SID-1)等基因的相对表达量上调。接着,将体外合成的RNAi途径相关基因片段的dsRNA转染褐飞虱培养细胞,再用RRSV侵染。免疫荧光实验结果发现,干扰siRNA途径中的Dicer2和Ago2基因的表达,能显著提高RRSV在褐飞虱培养细胞的侵染率,而干扰miRNA途径中的Dicerl和Agol基因、piRNA途径中Piwi和Ago3基因以及Eri-la和Eri-lb基因的表达不影响RRSV在褐飞虱培养细胞中的侵染率。上述结果表明,褐飞虱siRNA途径参与调控了RRSV在褐飞虱培养细胞中的侵染复制,而miRNA途径和piRNA途径可能不参与调控RRSV在褐飞虱培养细胞中的侵染复制。RT-qPCR实验结果也进一步表明,转染dsDicer2和dsAgo2褐飞虱培养细胞,RRSVP8基因的积累量显著提高,而转染dsAgo1、dsAgo3、dsDicer1、dsEri-la、dsEri-lb、dsPiwi和dsSID-1等dsRNA后,RRSVP8基因的积累量无显著变化。本研究对褐飞虱抗病毒免疫方式进行了初步探究,明确了褐飞虱细胞内siRNA途径是调控RRSV侵染、复制增殖的有效途径,且该途径中发挥作用的关键因子为Dicer2和Ago2；而miRNA途径和piRNA途径可能不参与调控RRSV侵染、复制增殖。这些结果为明确植物病毒在介体昆虫体内受到的RNAi机制,解析病毒与介体昆虫的互作关系和协同进化机制奠定了基础,为阻断褐飞虱传播RRSV防控水稻齿叶矮缩病提供新的可能依据。
【关键词】：水稻齿叶矮缩病毒 RNAi 褐飞虱 细胞培养
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S435.11
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 1. 前言11-27
• 1.1 水稻锯齿叶矮缩病的相关研究进展11-17
• 1.1.1 水稻锯齿叶矮缩病的发现与发生11-12
• 1.1.2 病毒的寄主范围及危害症状12-13
• 1.1.3 病毒的特征及分类地位13-15
• 1.1.4 病毒的分子生物学研究15-16
• 1.1.5 RRSV传播介体及其传毒方式16-17
• 1.2 昆虫细胞培养及其应用17-21
• 1.2.1 细胞培养概述17-18
• 1.2.2 昆虫细胞培养的应用18-20
• 1.2.3 昆虫细胞培养基20-21
• 1.3 昆虫体内的抗病毒免疫21-25
• 1.3.1 RNAi的机制及其应用22-24
• 1.3.2 RNAi在抗病毒方面的应用24-25
• 1.4 本实验的研究目的和意义25-27
• 2 材料和方法27-43
• 2.1 材料27
• 2.2 实验试剂与实验仪器27-28
• 2.3 实验方法28-43
• 2.3.1 褐飞虱细胞的培养28
• 2.3.2 源于褐飞虱抗病毒免疫基因片段dsRNA的体外合成28-35
• 2.3.3 RRSV病毒侵染液的筛选35-37
• 2.3.4 目的基因dsRNA转染对RRSV侵染褐飞虱单层培养细胞的影响37
• 2.3.5 免疫荧光检测37-38
• 2.3.6 RT-qPCR检测38-43
• 3. 结果与分析43-61
• 3.1 褐飞虱细胞的体外培养43-44
• 3.2 RRSV高效侵染液的制备44-47
• 3.3 RRSV的侵染激活了褐飞虱培养细胞内RNAi途径相关基因的表达47-48
• 3.4 褐飞虱RNAi途径相关基因dsRNA的合成48-50
• 3.4.1 褐飞虱RNAi途径相关基因的扩增48-49
• 3.4.2 褐飞虱RNAi途径相关基因dsRNA的体外合成49-50
• 3.5 褐飞虱调控RRSV侵染细胞的RNAi途径50-59
• 3.5.1 siRNA途径调控RRSV在培养细胞中的侵染51-53
• 3.5.2 miRNA可能不参与调控RRSV对褐飞虱培养细胞的侵染53-55
• 3.5.3 piRNA途径对RRSV侵染褐飞虱培养细胞的影响较小55-57
• 3.5.4 褐飞虱Eri-like基因对RRSV侵染其培养细胞的调控作用不显著57-59
• 3.6 RNAi相关基因dsRNA对褐飞槰培养细胞内相应基因表达量的影响59-61
• 4. 讨论61-66
• 4.1 褐飞虱RNAi抗病毒途径分析61-63
• 4.2 关于RRSV侵染不稳定现象的分析63-66
• 参考文献66-77
• 附录77-79
• 致谢79

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本文编号：998367