TALE酶介导的基因定点整合及原位修复研究

发布时间：2021-08-23 09:45

　　摘要：同源重组介导的基因定点整合以及原位修复是比较理想的基因编辑方式。但是由于细胞中内在的同源重组效率很低,所以这两种策略的应用在研究中还并不普及。类转录激活因子样效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALENs）的出现,可能会大幅度推进这类定点基因编辑技术的发展。本研究在以往研究的基础上,探讨TALENs以及我们自主设计改造的类转录激活因子样效应物切口酶（Transcription activator-like effector nickases, TALENickases）在促进细胞同源重组效率方面的作用。第一章TALE酶促进rDNA区定点整合研究目的：探索TALENs和TALENickases促进多拷贝rDNA位点转基因定点整合的能力及其细胞毒性方面的区别,以评估TALE酶应用于rDNA区基因打靶的可行性。方法：（1）为了在转染细胞后实时观察定点整合效率,我们构建了一个能够将无启动子GFP序列定点靶入rDNA区的基因打靶载体；（2）我们将该打靶载体联合TALENs或者TALENickases表达载体共转染... 

【文章来源】：中南大学湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：127 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

PI复染检测细胞调亡如图所示，与三种TALENickases相比，TALENs具有显著高的细胞毒性

donor vector pHniF9 Z =t- mES-Neo H efi-fix ^^H Homologous RecombinationPol I _F1?taraeted allele p 10.3 kb Pvun Pvun图l-5pHmF9基因打把示意图该栽体总共含有5.6kb的同源序列，可将无启动子的IRES-Neo表达框以及完整的EFl-HX表达框定点入到rDNA的5468位点。本实验中单独使用pHmF9对HT1080细胞进行了核转，同时也使用pHmF9联合上述所有的TALENs/TALENickases组合进行了基因打祀。在克隆筛选12天后挑取了一部分克隆进行初步的PCR检测，剩余的克隆用Giemsa染液染色用于拍照和计数(图1-6)。

图1 -1 pHmF9联合TALENs/TALENickases打把HT1080抗性克隆鉴定A,使用引物Sreen-EC和Sreen-DN进行PCR检测，定点整合克隆可?T增出一条1.4kb的条带，而未发生定点整合的克隆不能扩增出PCR产物；B,使用方法部分标记的探针通过Southern blot对PCR阳性的克隆进行检测，定点整合的克隆理论上能够检测到一条10.3kb的条带，同时无论是定点整合克隆还是未转染的HT1080细胞都会固定地检测到一条4.3kb的条带；C,通过PCR、Southern blot以及抗性克隆数计算出每个组合的基因打把效率，并根据三次实验的数据绘制柱状图。

【参考文献】：
期刊论文
[1]Efficient and Specific Modifications of the Drosophila Genome by Means of an Easy TALEN Strategy[J]. Jiyong Liu~a,Changqing Li~a,Zhongsheng Yu~a,Peng Huang~b,Honggang Wu~a,Chuanxian Wei~a, Nannan Zhu~a,Yan Shen~b,Yixu Chen~a,Bo Zhang~b,Wu-Min Deng~(c,*),Renjie Jiao~(a,*) a State Key Laboratory of Brain and Cognitive Science,Institute of Biophysics,The Chinese Academy of Sciences,Datun Road 15,Beijing 100101,China b Key Laboratory of Cell Proliferation and Differentiation of Ministry of Education,College of Life Sciences,Peking University,Beijing 100871,China c Department of Biological Science,Florida State University,Tallahassee,Florida 32304-4295,USA.  遗传学报. 2012(05)



本文编号：3357635