钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL21核酸疫苗的研制及对豚鼠的免疫保护作用

发布时间：2018-07-07 13:08

  本文选题：钩端螺旋体 + 外腆脂蛋白　； 参考：《南华大学》2006年硕士论文

【摘要】：目的；构建钩端螺旋体外膜脂蛋白lipL21基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-lipL21，直接肌注免疫豚鼠，观察其在豚鼠体内所产生的体液免疫和细胞免疫应答水平，研究其对豚鼠的兔疫保护作用，为研制高效的钩端螺旋体新型疫苗提供实验依据。 方法：根据GenBank钩端螺旋体外膜脂蛋白lipL21基因的基因序列AY187271，设计相应特异性引物，PCR扩增目的基因片段(561bp)，纯化回收后将其插入pUCm-T载体，通过蓝白斑筛选，酶切分析、PCR鉴定筛选阳性重组体；将lipL21基因亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)，构建pcDNA3.1(+)-lipL21重组体，，将其转染HeLa细胞，用免疫细胞化学及SDS-PAGE分析鉴定lipL21在HeLa细胞中得到表达后，于0w、2w、4w将核酸疫苗pcDNA3.1(+)-lipL21及对照空质粒pcDNA3.1(+)和对照PBS分别经豚鼠右后腿股四头肌肌肉注射免疫豚鼠，每次剂量为100μg／只，末次免疫后2w，以培养10d的56601株培养物从腹腔攻击各免疫组豚鼠(2mL／只)，连续观察15d，观察各免疫组豚鼠的发病情况，并取各免疫组豚鼠的肺、肝、肾做病理切片，HE染色观察比较各免疫组豚鼠的组织病理变化，分析重组体pcDNA3.1(+)-lipL21对豚鼠的免疫保护作用。并无菌分离豚鼠脾淋巴细胞，经非特异性抗原植物血凝素(PHA)刺激后，MTT法和淋巴细胞转化试验测定各免疫组豚鼠脾淋巴细胞的体外增殖情况，显微镜凝集试验(MAT法)测定各免疫组豚鼠血清中抗LipL21抗体水平，PCR法检测lipL21基因在免疫豚鼠肌细胞内是否存在。 结果：成功扩增出lipL21基因，并构建了真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-lipL21，重组质粒转染HeLa细胞48h后，免疫细胞化学结果显示在HeLa细胞胞浆内有棕黄色的阳性产物，而pcDNA3.1(+)转染的HeLa细胞胞浆内未观察到棕黄色的阳性产物，SDS-PAGE结果显示目的基因能在HeLa细胞表达Mr约21kDa的蛋白。MAT结果显示
[Abstract]:Objective: to construct eukaryotic expression vector pcDNA3.1 () -lipL21 of leptospirosis outer membrane lipoprotein (lipL21) gene, directly injected intramuscularly to immunize guinea pigs, to observe its humoral and cellular immune responses in guinea pigs, and to study its protective effect on guinea pigs. To provide experimental basis for the development of a novel vaccine against leptospira. Methods: according to the gene sequence of Leptospira leptospira outer membrane lipoprotein lip21 gene AY187271, a specific primer was designed to amplify the target gene fragment (561bp). After purification and recovery, the fragment was inserted into pUCm-T vector. LipL21 gene was subcloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1 (), to construct pcDNA3.1 () -lipL21 recombinant, which was transfected into HeLa cells. The expression of lipL21 in HeLa cells was identified by immunocytochemistry and SDS-PAGE analysis. The nucleic acid vaccine pcDNA3.1 () -lipL21, the control plasmid pcDNA3.1 () and the control PBS were injected intramuscularly into the quadriceps femoris muscle of the right hind leg of guinea pigs at a dose of 100 渭 g / mouse each time. Two weeks after the last immunization, 56601 strains cultured for 10 days were used to attack the guinea pigs (2mL / mouse) from the abdominal cavity. For 15 days, the incidence of the guinea pigs in each immunization group was observed, and the lungs and liver of the guinea pigs were taken out. The histopathological changes of guinea pigs in each immunized group were observed by HE staining and the protective effect of recombinant pcDNA3.1 () -lipL21 on guinea pigs was analyzed. The splenic lymphocytes of guinea pigs were isolated aseptically. The proliferation of splenic lymphocytes of guinea pigs in different immune groups was determined by MTT assay and lymphocyte transformation test after stimulation with nonspecific antigen phytohemagglutinin (PHA). Microscopical agglutination assay (mat) was used to detect the level of anti-LipL21 antibody in the serum of guinea pig immunized groups. The presence of lipL21 gene in the myocytes of immunized guinea pigs was detected by PCR. Results: lipL21 gene was successfully amplified, and the eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1 () -lipL21 was constructed. After 48 hours of transfection of the recombinant plasmid into HeLa cells, the immunocytochemical results showed that there were brown yellow positive products in the cytoplasm of HeLa cells. However, in the cytoplasm of HeLa cells transfected with pcDNA3.1 (), no brown-yellow positive product was observed. SDS-PAGE results showed that the target gene could express a protein of about 21 kDa in HeLa cells. Mat results showed that the target gene could express a protein of about 21 kDa in HeLa cells.
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R392

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本文编号：2105058