抗心肌肥大多肽GCIP基因的克

发布时间：2020-07-03 01:12

【摘要】： 心肌肥大是心肌细胞对多种病理刺激的一种共同应答方式，是指心肌细胞的体积增大而数量不变。由心肌肥大而心衰，由心衰而死亡是上述临床病人的主要死亡原因之一。因此，探索治疗和控制心肌肥大的特异性有效药物不仅是当今世界科学家们面临的主题和研究热点之一，也是我国医学领域急待解决的重要课题。已有研究表明，无论牵张刺激或是体液内分泌物质如内皮素、血管紧张素Ⅱ、去甲肾上腺素等诱导心肌肥大的信号转导过程中G蛋白起着“分子开关”样的重要作用。新近报道G alpha的竞争性抑制肽(GCIP)在转基因实验动物模型上，对手术逆向主动脉缩窄模型(TAC)的心肌肥大及内皮素、血管紧张素Ⅱ等刺激的MAPK活性改变均具有很好的抑制效果，且在试验过程中未观察到任何毒副反应，因此成为极有希望的抗心肌肥大新型药物，而具有广阔的开发应用前景。本实验拟通过基因工程和蛋白质工程技术，首次表达及纯化GCIP，并对GCIP的抗心肌肥大活性进行初步研究。旨在为进一步研究其抗心肌肥大功能及其机制奠定基础。并为最终获得具有特异性抗心肌肥大生物活性的信号转导靶向多肽分子药物提供理论依据。方法：1．化学合成GCIP基因，分段克隆入pIVEX2.3MCS质粒，并测序鉴定；2．分别用RTS500系统和BL21(DE3)细菌表达GCIP，SDS-PAGE及Western blotting鉴定；3．用镍螯合亲和层析方法纯化GCIP，细菌表达的GCIP采用固相复性方法，对变性蛋白进行复性；4．采用乳鼠心肌细胞培养，去甲肾上腺素致肥大模型，测3H-亮氨酸掺入量及总蛋白含量。结果：1．构建的pIVEX2.3MCS-GCIP表达载体，测序结果与设计的完 WP=8 全一致。2．用RTS500系统和BL21(DE3)细菌成功表达了的GCIP，RTS表达的GCIP占反应液总蛋白的2.43%；BL21(DE3)细菌表达GCIP为包涵体， 37℃ 4小时表达量为细菌总蛋白的6.55%、包涵体中的GCIP含量达53%；30℃ 12小时表达量为细菌总蛋白的9.13%、包涵体中的GCIP含量高达73%以上。3．RTS系统和BL21细菌表达的GCIP经镍柱纯化后，SDS-PAGE显示均能得到一条分子量约8.5kD的单一的条带。4．对GCIP的抗心肌肥大作用做了初步研究，结果显示10ng组3H-Leu掺入量和总蛋白含量已有下降趋势，但统计分析相差不显著，100ng组GCIP已明显减少3H-Leu掺入量和总蛋白含量（P0.01），1μg组和10μg组更低，但与100ng组相比相差无明显统计学差异(提示达到饱和浓度)。结论：1．构建了GCIP的表达载体pIVEX2.3MCS-GCIP。2．成功用RTS500系统表达GCIP蛋白，并经镍柱纯化，其表达量约为100μg/ml。3．成功用BL21（DE3）细菌表达GCIP，表达量约占菌体总蛋白的10%，并经镍柱纯化及复性，产量为250ml菌液约纯化得1.5mg GCIP。4．GCIP具有抗心肌肥大活性且呈剂量依赖性
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R346
【图文】：

酶切鉴定,军医大学,位点,硕士学位论文

军医大学硕士学位论文 GCIP 基因的克隆、表达及其抗心肌肥大作用的结果EGFP-A 的构建成的第一、二条寡核苷酸单链退火后形成的带粘性末端的双A，定向克隆入 pEGFP-N1 质粒的 Xho I 位点和 Pst I 位点之间称之为 pEGFP-A。其筛选和鉴定可通过 Hind Ⅲ和 Pst I 分酶切，如能被 Pst I 切开，而不能被 Hind Ⅲ切开，则为阳性重 2）

聚合酶,宿主,基因,启动子

·15·图 4 pIVEX2.3MCS-GCIP 质粒测序图（仅为其中一小部份）测序结果与设计要求对比完全一致，可以进行表达工作。讨论一、表达系统的选择分析 GCIP 基因内仅有一个半胱氨酸，分子内没有二硫键，且未见其分子需要糖基化或磷酸化的报道，故可选用原核表达系统。在原核表达系统中T7 RNA 聚合酶/启动子表达系统是利用 T7 RNA 聚合酶对 T7 基因 10 启动子的高效转录而大量合成外源基因的mRNA。但 T7 RNA 聚合酶的高效转录作用几乎耗尽细胞中的核苷三磷酸，从而抑制宿主 RNA 聚合酶有效转录宿主基因，抑制宿主细菌的生长繁殖。解决方案主要有两种：一是通过体外翻译系统进行表达，目前通用的不多。二是使细菌在生长期不表达或低表达 T7 RNA

【参考文献】