凋亡素基因原核及真核表达载体构建研究

发布时间：2020-07-04 14:26

【摘要】：目的：(1)构建凋亡素基因原核表达载体，诱导表达、提纯凋亡素融合蛋白，为进一步制备其单克隆抗体提供物质基础；(2)构建带真核核糖体结合位点(Kozak序列)的凋亡素基因真核表达载体，提高凋亡素基因在肿瘤细胞中的表达效率。 方法：以pcDNA-VP3质粒为模板，通过一次PCR方法，扩增出不带真核核糖体结合位点的凋亡素VP3基因；通过两次PCR方法，扩增出带有真核核糖体结合位点的凋亡素VP3基因。分别将其克隆到原核表达载体pET-DsbA及真核表达载体pRevTRE的多克隆位点，构建成凋亡素基因原核表达载体pET-DsbA-VP3及真核表达载体pRevTRE-VP3，进行双酶切及测序鉴定。进一步将正确克隆有凋亡素基因的原核表达质粒转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)plysS中，以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG)诱导表达，固化Ni离子金属鏊合纯化带6X组氨酸标签的凋亡素融合蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白。 结果：凋亡素基因原核及真核表达载体测序鉴定结果表明，本研究合成的凋亡素基因与Noteborn等报告的凋亡素基因序列一致，同源性为100％，并在真核表达载体凋亡素基因起始密码前添加了Kozak序列。转化的E.coliBL21(DE3)plysS经IPTG诱导，固化Ni离子金属鏊合亲和层析纯化蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳获得分子量为38.3KD的目的蛋白条带。 结论：(1)构建的凋亡素基因原核表达载体pET-DsbA-VP3能表达出凋亡素融合蛋白；(2)通过两次PCR的方法，能扩增出起始密码5’端添加Kozak序列的凋亡素基因，并能成功构建其真核表达载体pRevTRE-VP3。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R346
【图文】：

士学位论文结果素原核表达载体的构建及表达pET一nsbA及pET一nsb舟vp3转化结果pET一DsbA及pET一DsbA一vP3转化感受态节阳性的LB培养平板，倒置于37℃恒温一Zllun乳白色菌落，见图1、图2。

士学位论文结果素原核表达载体的构建及表达pET一nsbA及pET一nsb舟vp3转化结果pET一DsbA及pET一DsbA一vP3转化感受态节阳性的LB培养平板，倒置于37℃恒温一Zllun乳白色菌落，见图1、图2。

【参考文献】

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本文编号：2741219