人乳头瘤病毒16型L1蛋白的表达及其免疫效果的研究

发布时间：2020-07-08 15:01

【摘要】：人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)与宫颈癌的密切关系已经证明预防性疫苗可以减少在全世界范围由HPV感染的发生。无感染性的HPV L1蛋白可以自发组装成病毒样颗粒(virus-likeparticle，VLP)，是目前预防HPV感染和子宫颈癌很好的候选疫苗。由于50％的宫颈癌与HPV16感染相关，所以用这一型作为疫苗，可以减少HPV感染年轻妇女的死亡率。Ⅲ期临床试验表明，HPV16的VLP疫苗在保护HPV16感染的有效性可达到91％。目前，HPV16 L1疫苗主要在酵母菌、昆虫细胞和原核表达系统中表达和纯化，但其昂贵的生产工艺阻碍其广泛应用。本文使用酵母表达系统和乳杆菌表达系统首次将表达的HPV16 L1蛋白分泌并锚定在细胞膜的表面，与菌体一起用药，无需纯化，廉价安全。本文主要有三方面内容：一、HPV16 L1蛋白在大肠杆菌中的高效表达利用PCR技术扩增得到酶切位点修饰的HPV16 L1片段，克隆到T-easy载体，测序正确后以Kpn1和Xho1酶切回收目的片段，然后连接到pET32a载体，转化大肠杆菌BL21后表达，SDS-PAGE电泳鉴定，其表达形式以包涵体为主，并采用亲和层析初步建立了HPV16 L1蛋白纯化工艺。ELISA、Western Blot鉴定结果表明，融合蛋白Trx-HPV16 L1能够识别并结合HPV16 L1单抗，而单独的Trx蛋白与HPV16 L1单克隆抗体不具有亲和活性，表明融合蛋白与 HPV16U单抗结合是特异的，所以可将纯化的蛋白HPV16 Ll作为检测酵母菌EBYI仪I/PYD 1.HPV16LI、乳杆菌89(为压SCinAE书rV16LI 通过灌胃、滴鼻、皮下注射等途径免疫小鼠产生HPv16LI抗体的抗原。二、表达载体PYDI.HPV16LI的构建和HPV16U蛋白在酵母菌 EBYloo膜表面的表达利用PCR技术扩增得到酶切位点修饰的HPV16 Ll片段，克隆到T一easy载体，测序正确后以KPnl和肠o1酶切回收目的片段，然后连接到PYDI表达载体，转化酵母菌EBY100后表达，EUSA、 IFA鉴定缮果表明蛋白与HPv16LI单抗的结合是特异的，皿结果表明表达的蛋白被分泌到酵母菌外并锚定在膜的表面。三、表达载体PSCn1AE一PV16LI的构建和HPV16LI蛋白在德氏乳杆菌8909膜表面的表达利用PCR技术扩增得到酶切位点修饰的HPV16 Ll片段，克隆到T一easy载体，测序正确后以Sfil和Ascl酶切回收目的片段，然后连接到PSCnl AE表达载体，电转化德氏乳杆菌8909后表达， EUSA、Westem Bfot鉴定结果表明，蛋白与HPV16 Ll单抗的结合是特异的。总之，我们已成功的在酵母菌EBYIOO和乳杆菌DM8909的细胞表面表达HPv16LI蛋白，如果疫苗免疫小鼠证明有效，就可为疫苗的发展提供新的途径。
【学位授予单位】：内蒙古师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R392.1
【图文】：

PCR扩增,分子大小,质粒,模板

1.2HPV16型Ll基因的PCR扩增以PUC16服Pv16Ll质粒为模板进行PcR扩增，获得一条分子大小约为1.skb的人乳头瘤病毒16型Ll基因片段(图2一1)。12绷哪绷剑100卜卜卜卜1.HPV16LIPCRfra卯坦ni2.DLZ，000Marker图2一1HPv16LI基因片段的PCR扩增Fig.2一1PCRarnP肪eationofHPV16LI

图谱,酶切鉴定

5(X)0Marker2.DLZ，000Marker3.KPnl+X上。1山罗stion4.PCRalnPification5.PET32a(+娜PV16LIPlas面d图2一3pEr32a(+)压Jv16LI的酶切鉴定图谱Fig.2一3RestriClionanylysisofrecombinaniPlasrnidofP盯32a(+)旧PV16LlA:1234SB:1234jjj97KD66KD叫卜97KD礴一66KD叫卜-47KD47KD31KDee书呀一31KDA:1.Pro.einMar址rZ，3.竹笼一HPV16L14，5.P曰32a(+)conirolB:l，2.h喊pitate3.ProteinMar址r4.乳拌n.tani图2一5pEr32a(+)居任v16LI在Ecoli中表达的sDs

包涵体,融合蛋白,复性,尿素

3.1包涵体的洗涤将包涵体用Zmo比的尿素+1%SDS和Zmo呱的盐酸孤各漂洗两次，能去除大部分菌体蛋白(见图2一7)，包涵体没有溶解。3.2包涵体变性将包涵体用6mo呱尿素直接变性溶解，实验证实融合蛋白Trx.HPvl6LI无需添加Dl，r、疏基乙醇或还原型谷肤甘肤就能很好的溶解，表明融合蛋白的二硫键主要以还原态的形式存在。3.3融合蛋白柱层析复性与纯化采取透析复性与柱上复性相结合的方法，逐步去除变性剂，靶蛋白含有6xHis标签，吸附在镍离子金属鳌合柱上，经10Ommol/L咪哇洗脱去除杂蛋白后，300们。们n01几咪哇洗脱活性蛋白峰(见图2一8)

【参考文献】