人CD154基因真核表达载体的构建及在Eca109细胞中的表达

发布时间：2020-07-08 17:39

【摘要】： 背景：CD8~+效应T淋巴细胞(CD8~+CTL)介导的抗原特异性细胞免疫反应在机体的抗肿瘤免疫反应中发挥关键性作用。但肿瘤抗原特异性CD8~+CTL数量上的扩增和特异性肿瘤杀伤活性的激发必须有CD4~+ T淋巴细胞的辅助与成熟的树突状细胞(mDC)对肿瘤抗原的有效递呈。CD154／CD40信号转导途径是介导CD4~+T淋巴细胞的辅助作用与诱导树突状细胞完全成熟并获得抗原递呈与免疫刺激能力的重要途径。CD154(CD40L，TRAP，gp39)属于TNF基因家族成员，是一个由261个氨基酸组成的Ⅱ型跨膜糖蛋白，分子量33kDa，主要瞬时表达于人活化的CD4~+T淋巴细胞、部分活化的CD8~+T淋巴细胞和γ δT淋巴细胞表面，是参与机体特异性细胞免疫应答和体液免疫应答的重要免疫共刺激分子。CD154蛋白的受体CD40分子是一个由277个氨基酸组成的Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子量48kDa，属于TNF受体超家族成员，CD40分子分布于B细胞、单核细胞、内皮细胞、树突状细胞(dendritic cell，DC)、滤泡树突状细胞(follicular dendritic cell，FDC)、巨噬细胞、上皮细胞、造血干／祖细胞及多种肿瘤细胞表面。CD40／CD154相互作用不仅介导B细胞活化、增殖、分化、抗体产生与Ig类型转换，而且CD4~+T淋巴细胞、DC、CD8~+T淋巴细胞间CD40分子与CD154分子介导的双向信号流动是调控T淋巴细胞与DC活化、增殖，启动并维持机体特异性细胞免疫反应以及建立机体CTL记忆效应的关键性信号转导通路。CD40／CD154信号转导通路在DC发育成熟及发挥抗原递呈、免疫激活功能中的作用主要表现在：(1)促进DC增殖、分化与成熟，上调未成熟DC细胞表面CD83、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD54(ICAM-1)、CD58(LFA-3)等免疫辅助分子的表达。郑州大学2003届硕士学位论文人CD154基因真核表达载体的构建及在Ecal09细胞中的表达 (2)促进DC从外周向淋巴结迁移及DC在淋巴结内存活，增加淋巴结内递呈抗原的成熟DC的数量，延长DC有效递呈抗原的时间。(3)增加DC IL一12的分泌量，诱导较强的Thl类反应及细胞毒性T细胞应答。(4)增加DC分泌促炎症性细胞因子IL一lp，IL一6，IFN一Y，TNF一a，进一步促进DC的成熟活化与免疫刺激功能。(5)上调DC表达对T细胞活化、增殖存活具有重要作用的分子OXCD40L，4一1 BBL和 eo27L(en7o)，成熟nC表达的oXCD40L与表达在激活的CD4‘T淋巴细胞和激活的CDS‘T淋巴细胞表面的OXCD40相互作用，增强T淋巴细胞与DC的活化和分化，促进IL一12合成增多。4一IBBL/4一IBB共刺激信号协同B7/ CD28共刺激信号作用，抑制成熟T淋巴细胞AICD(aetivation indueed Cell death)的发生。4一IBBL和 CD27L不仅向增生的CDS+T淋巴细胞提供关键性的存活信号，促进CTL杀伤效应的发挥，而且在维持cTL免疫记忆中起重要作用。(6)CD154/CD40结合激活DC后分泌的细胞因子和趋化因子如IL一lp，IL一8，IL一12，巨噬细胞炎症蛋白一IY (maCrophage inflammatory protein一Iy，MIP一IY)等促进抗原特异性的eDS+eTL 克隆性扩增及在外周血、淋巴结、脾脏的分布，增加肿瘤部位CDS+CTL浸润、富集。(7)经CD 1 54/CD40结合激活的DC能够拮抗肿瘤微环境中肿瘤细胞分泌的抑制性细胞因子如IL一10的阻抑作用。(8)表面MHC分子结合有抗原的DC经 CD154/CD40信号转导激发后不需CD旷T淋巴细胞辅助，直接激活CDS+T淋巴细胞产生针对靶细胞的特异性杀伤作用。CD4O+肿瘤细胞表面的CD40分子被CD154 分子结合后因肿瘤细胞组织来源不同，去分化程度差异及CD40分子表达的细胞膜表面分子背景不同而产生截然相反的效应。在低分级(低度恶性)B细胞恶性肿瘤、霍奇金氏病、HIV相关淋巴瘤、膀肤癌上CD40分子被CD154分子结合传递抗凋亡信号，促进肿瘤细胞存活与增殖。对卵巢癌、宫颈癌、恶性黑色素瘤、喉癌等肿瘤的研究显示这些肿瘤细胞膜上的CD40分子被CD154分子结合引起细胞周期停滞在 GZ一M期，且可增强刺激物如细胞毒药物顺铂、TNF一a、抗Fas和神经酞胺诱导的凋亡。CD154分子在肝癌、多发性骨髓瘤上与CD40分子结合后导致相反的效应，可以促进肿瘤细胞增殖，也可增强肿瘤细胞凋亡。利用转染CD154基因的肿瘤细胞及重组CD154分子进行肿瘤免疫治疗的动物实验与临床I期研究结果鼓舞人心，显示了诱人的临床应用前景。目的:获得人cD154基因真核表达载体peDNA3.1一cD154与稳定表达重组郑州人学2003届硕士学位论文人＊m 54补月真核表达载体的构建及在优。川9细胞中的表达 CD154分子的食管癌细胞株Ecal09，初步观察转染CD154基因后Eca109细胞的细胞生物学特性。方法：应用淋巴细胞分层液密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞，体外经 PHA激活 8 ’J’时后提取总 RNA，利用 RT－PCR和巢式 PCR技术扩增人 CD154 cDNA 全长，用 T－A克隆的方法构建克隆载体 pUC18（D154质粒，采用 BamH单酶切从 pUC18（质粒上切下 CD154 CDNA全长后同去磷酸化的 BamH单酶切 pCDNA3．l质粒亚克隆构建真核表达载体pCDNA3．ICD154，用质粒多克隆位点上游的T7通用引物与巢式PCR内下引物PCR扩增一步鉴定CD154 CDNA正向插入的重组质粒 PcDNA3．ICD154
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R346

【参考文献】