一、幽门螺杆菌napA基因的原核表达及初步分析 二、幽门螺杆菌vacA毒性片段与cagA融合基因的原核表达

发布时间：2020-07-09 12:35

【摘要】：目的: 采用基因工程技术获得高效表达的重组幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）中性粒细胞激活蛋白Nap,为研制H.pylori疫苗提供有效抗原，为探讨Nap致病机理、检测H.pylori感染患者血清Nap抗体提供材料。 方法：用PCR从Helicobacter pylori 临床分离株DNA中扩增出目的基因napA，定向插入原核表达载体pQE30中，测序分析确认后，转化表达受体菌DH5a， SDS-PAGE分析表达情况，Western blot检测其抗原性。Ni2+-NTA树脂纯化后，用重组蛋白免疫兔,鉴定其免疫原性。并以纯化的重组蛋白为抗原，建立检测血清Nap抗体的间接ELISA法，对H.pylori患者血清进行检测。 结果： 1.PCR扩增出435bp目的基因片段napA，克隆入pQE30质粒。序列分析所得序列完整，与Genbank中的H.pylori菌株相比有高度同源性，与文献报道的中国菌株相比同源性达97.4%；2.工程菌诱导后SDS-PAGE显示新生蛋白带，相对分子量为17×103，与预期一致，约占菌体总蛋白的38.8%；3.Western blot显示重组蛋白可被H.pylori感染患者阳性混合血清所识别；4.SDS-PAGE分析 WP=7 表明目的蛋白主要以包涵体形式表达，经NI2＋-NTA柱纯化，可获得纯度为92.5%重组蛋白；5.纯化蛋白免疫兔后，所得免疫血清可与H.pylori全菌抗原发生反应，具有良好的免疫原性 ；6.用重组蛋白建立检测血清Nap抗体的间接ELISA法，敏感性与特异性分别是86.7%和100%。　 结论：H.pylori napA基因原核表达载体构建成功，并在大肠杆菌中高效表达，重组蛋白具有良好的抗原性与免疫原性，经NI2＋-NTA柱纯化可获得高纯度的目的蛋白，为进一步制备H.pylori疫苗提供了有效的候选抗原，此抗原可用于H.pylori感染患者血清Nap抗体的检测和致病机理的研究。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R378

【参考文献】

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本文编号：2747462