B群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白NMB0315核酸疫苗的免疫活性和免疫保护作用研究

发布时间：2017-03-29 15:10

  本文关键词：B群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白NMB0315核酸疫苗的免疫活性和免疫保护作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：[目的]构建B群脑膜炎奈瑟菌pc DNA3.1(+)/NMB0315真核表达重组载体,免疫雌性BALB/c小鼠,检测其诱导小鼠产生的特异性体液免疫和细胞免疫应答水平、免疫血清体外杀菌效果及免疫保护作用,初步探讨pc DNA3.1(+)/NMB0315核酸疫苗的免疫活性和免疫保护效果,为研制一种新的预防B群流脑的核酸疫苗提供可靠的实验依据。[方法]以B群脑膜炎奈瑟菌标准株MC58基因组DNA为模板,PCR扩增NMB0315基因,克隆至pc DNA3.1(+)载体中,经Bam H I和Xho I双酶切及测序鉴定重组载体。将构建好的pc DNA3.1(+)/NMB0315重组载体经脂质体转染COS-7细胞和RAW264.7细胞,采用免疫组织化学和Western blot法检测重组蛋白在真核细胞中的表达,RT-q PCR法检测NMB0315基因m RNA的相对表达水平。大量提取重组质粒,肌肉或腹腔皮下注射法免疫雌性BALB/c小鼠,间接ELISA法检测核酸疫苗免疫小鼠血清中抗NMB0315特异性总Ig G及其亚类抗体水平、小鼠生殖道黏膜分泌物中抗NMB0315特异性s Ig A抗体水平及经pc DNA3.1(+)/NMB0315刺激后小鼠脾淋巴细胞上清液中IFN-γ、IL-4水平,CCK8法检测小鼠脾淋巴细胞增殖刺激指数(SI);按一定比例混合乳兔补体、免疫血清及生长至对数期的MC58菌液,测定免疫血清体外杀菌效价;观察pc DNA3.1(+)/NMB0315核酸疫苗对感染B群脑膜炎奈瑟菌雌性BALB/c小鼠的免疫保护效果。[结果]成功构建的真核表达载体pc DNA3.1(+)/NMB0315能够在真核细胞中有效转录和表达。pc DNA3.1(+)/NMB0315核酸疫苗具有良好的免疫原性,能诱导小鼠产生较高水平的体液免疫应答:包括血清特异性Ig G、Ig G1、Ig G2a、Ig G3、Ig G2b和生殖道黏膜特异性s Ig A,免疫后第6周抗体效价分别为1:50,000、1:40,000、1:35,000、1:30,000、1:15,000和1:30,000;在核酸疫苗免疫的2、4、6周,血清Ig G2a/Ig G1的比值分别为0.775,0.744,0.614,比值均小于1。核酸疫苗也能诱导产生较高水平的细胞免疫应答,疫苗免疫第6周,小鼠脾淋巴细胞增殖反应SI值(1.87±0.124)明显高于PBS(0.68±0.132)、Cp G(0.71±0.153)和pc DNA3.1(+)(0.69±0.144)对照组(P0.001)。与体液免疫有关的细胞因子IL-4(181.87±24.31pg/m L)和细胞免疫有关的细胞因子IFN-γ(102.87±16.43pg/m L)的水平,pc DNA3.1(+)/NMB0315+CPG组均明显高于PBS、Cp G和pc DNA3.1(+)对照组(P0.001)。核酸疫苗免疫血清在补体介导下的体外杀菌抗体效价为1:128,72小时内对实验小鼠的免疫保护率为70%。[结论]1.核酸疫苗pc DNA3.1(+)/NMB0315具有良好的免疫原性,能诱导实验小鼠产生高水平的体液免疫和细胞免疫;也能诱导生殖道黏膜局部产生较高水平的特异性s Ig A抗体。2.核酸疫苗pc DNA3.1(+)/NMB0315对感染B群脑膜炎奈瑟菌的BALB/c小鼠具有良好的免疫保护效果;在补体介导下,末次免疫血清在体外具有较强的杀菌活性。
【关键词】：B群脑膜炎奈瑟菌 外膜蛋白0315 核酸疫苗 免疫活性 免疫保护
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 英文缩略语索引11-13
• 第1章 绪论13-15
• 第2章 实验材料15-19
• 2.1 主要的实验仪器15-16
• 2.2 菌株、质粒及试剂16-19
• 第3章 实验方法19-35
• 3.1 真核重组载体的构建及鉴定19-25
• 3.2 NMB0315基因在真核细胞中的表达25-30
• 3.3 B群脑膜炎奈瑟菌NMB0315核酸疫苗的免疫保护作用30-34
• 3.4 统计学处理34-35
• 第4章 实验结果35-63
• 4.1 真核表达载体pc DNA3.1(+)/NMB0315的构建及鉴定35-37
• 4.2 NMB0315 基因在真核细胞中的表达37-39
• 4.3 NMB0315 核酸疫苗免疫活性评价39-59
• 4.4 核酸疫苗的免疫保护效果和免疫血清体外杀菌活性59-63
• 第5章 讨论63-67
• 第6章 结论67-69
• 参考文献69-75
• 综述75-83
• 参考文献80-83
• 附录83-88
• 作者攻读学位期间的科研成果88-89
• 本研究受以下基金资助89-90
• 致谢90

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