癌胚抗原DNA疫苗的构建及佐剂对其免疫效应的影响

发布时间：2020-07-09 14:21

【摘要】： 癌胚抗原(carcinoembryonic antigen CEA)是一种最常见的肿瘤相关抗原(TAA)，也是国际上公认的肿瘤标志物，于1965年首次在人结肠癌和胰腺癌中发现，1987年克隆出它的全长基因序列。它是一种分子量约为180kd的糖蛋白分子，胚胎时期可正常表达分泌，并对胚胎的发育、组织形成及发展具有重要的作用。成年后，CEA的表达消失，但在胃肠道恶性肿瘤、胰腺癌、非小细胞肺癌和乳腺癌等癌细胞表面又可重新表达CEA，所以在成年人体内，CEA可作为肿瘤检测和治疗的靶分子。上述肿瘤细胞表面虽有CEA分子，但并不能激起机体针对CEA的特异性免疫应答，所以这些肿瘤细胞能逃避机体的免疫监视，发展成肿瘤。九十年代初，一种新型的疫苗-DNA疫苗的出现为解决CEA的免疫原性，打破机体免疫耐受提供了新的途径，同时也为CEA阳性肿瘤的治疗提供了新方法。核酸疫苗是指将含有编码肿瘤相关抗原基因的真核表达质粒，直接接种到动物体内，然后被动物细胞摄取并表达出相应的抗原，通过不同途径刺激机体产生针对该抗原的免疫应答，从而消除或抑制肿瘤细胞的生长。1994年，Conry 郑州大学医学院2002研究生毕业论文癌胚抗原＊＊A疫苗构建及佐剂对其兔疫效应的影响就构建了 CEA DNA疫苗，并在动物体内诱导产生了良好的兔疫效果。学者们为了增强DNA疫苗的免疫效果，主要采取以下措施： 1．免疫局部处理；2．应用高效、安全的表达载体；3．在DNA免疫中引入细胞因子或粘附分子；4．在疫苗中引入免疫刺激序列。本文运用基因工程技术构建了CEA的DNA疫苗PC工Cn，白细胞介素七的真核表达质粒PCI可L《，设计合成了硫代修饰的免疫刺激序列门SS），希望从载体、细胞因子和ES方面提高 CEA 的表达和抗｛EA的产生，从而达到对优A阳性肿瘤免疫防治的目的。材料和方法： 1．PCI｛n的构建制备和定量：ECORI酶切含仍A全基因的质粒 pGEM。－CEA，琼脂糖电泳回收2．4kb的片段，与经ECORI 酶切的真核表达质粒 pCI丁eo在 T4连接酶作用下连接，转化 DHS u菌， KR法筛选重组质粒，然后经＊ajnH工、Bg1H不对称酶切鉴定 2．4kb片段正确插入，命名为 pCI－CEA。重组质粒转化 DHS u，大量培养后，碱裂解法提取质粒，聚乙二醇法纯化，紫外分光光度法测量DNA纯度并定量。 2．PCI－IL－2的构建：用oligo 软件设计弓物，在上、下游引物的 5’端加上Xhol和 Sail酶切位点，以便于与载体连接。PCR法扩增几亿片段，在T4连接酶的作用下与 Xhol和 Sal工酶切的 pCI－neo载体连接，PCR法鉴定重组体，用 Xho工，Xhol＋Sal， Ban工工酶切进一步验证重组体，命名为pCllL－2。 3．DM免疫：对0．＊％的布比卡因注射入Mn几小鼠胜前肌，在＿2＿郑州大学医学院2002研究生毕业论文癌胚抗原＊＊A疫苗构建及佐剂对其兔疫效应的影响注射后第 3大分别接种浓度为 in g／ul的 CEA DNA疫苗及相应佐剂口SS或 gIL《厂每侧 50 u g，每组 5只小鼠，对照组注射 50 yi的PBS缓冲液。然后在第10、24大分别再免疫两次。 4．CEA DNA疫苗在体内诱导小鼠产生抗｛EA及 CEA的表达：于 DNA疫苗末次免疫后第1、2、4、6周分别采集小鼠血液以ELISA 方法检测小鼠血清中抗｛EA和 CEA。实验数据用 SPSS10．0软件分析比较其差异显著性。结果： 1．构建的 pCI－CEA，经ECORI酶切后获得2．4kb和 5．4kb的片段，经 BalnHI 酶切后获得 3．okb和 4．skb片段，经 Bglll 酶切后获得0．4kb和 7．4kb片段，与理论值一致。 2．构建的pCI－IL－2，经PCR扩增阳性，经XhOI酶切后获得6．Zkb 的片段，经 Xho工和 Sail酶切后获得 0．skb和 5．4kb片段，经 Banff酶切后获得 0．gkb．1．3kb和 3．Zkb片段，证明是所要构建的质粒。 3．DNA免疫后，CEA的表达：pCI－CEA组明显高于 pcDNA。－CEA组，检验差异有显著性。PC工－IL－2和 ISS未能增加 CEA的表达。 4．抗－CEA的产生：pCI－CEA组高于pCDNA。－CEA组，检验差异有显著性。ISS和白细胞介素－2质粒（PIL－2）均能增强抗－CEA分泌。本实验结果表明：载体、细胞因子和 ISS能增加 DNA疫苗的免疫效果，但如何增加 DNA疫苗的抗原表达量仍需探讨更为有效的方法。本实验为进一步提高 CEA DNA疫苗的免疫效果、作用机制及影响因素提供了实验依据，为进一步研究DNA免疫提供了参考。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R392

【参考文献】