甲状腺素抗体IgY制备和放免中的应用

发布时间：2020-07-10 05:22

【摘要】： 选择鸡作为免疫对象是因为其具有抗原所需剂量小，无需抽血就可以获得大量从血清转运至蛋黄中的抗体。此蛋黄中的抗体称为IgY(Yolk Immunoglobulin)。首先将T_4甲酯化再与牛血清白蛋白(BSA)偶联为全抗原，分别对A、B两只鸡进行免疫。A鸡首次免疫20μg。20天后实施加强免疫50μg。首次免疫后第62天实施第三次免疫100μg。首次免疫后第36天在血清中检测到抗体，蛋黄中则晚8天检测到抗体。B鸡首次免疫100μg，45天后实施第二次免疫。首次免疫后第35天在血清中检测到抗体，蛋黄中则晚6天检测到。在首次免疫后的两个月内两只鸡血清中抗体含量始终高于蛋黄，随着以后加强免疫，蛋黄中抗体含量增加并逐渐追上血清中抗体含量后超出，但两者间差距始终不很明显。总体看来A鸡抗体含量增高的趋势优于B鸡。本文观察到首次免疫与后来加强免疫剂量(A鸡全程免疫共用870μg抗原，B鸡共用950μg)对抗体产生起到重要的作用。高效价抗体在鸡最后一次免疫两个月后才有下降的趋势。蛋黄经去离子水1：2稀释后加等倍正丁醇去脂为宜；蛋黄1：2水稀释后，pH在5.0-10.0时蛋黄去脂上清IgY没有丢失；正丁醇去脂不同操作流程(4℃静置30min、室温静置30min、摇动后立即4℃3000xg离心15min)对IgY的含量和结合抗原的活性没有影响；正丁醇对IgY的活性无影响。另外正丁醇比水稀释法去除杂蛋白效果好。蛋黄正丁醇去脂后应用饱和硫酸铵和饱和硫酸钠两种不同盐析法纯化IgY进行比较，饱和硫酸铵略好于饱和硫酸钠盐析法，其纯化后所获得的产量达9.5mg IgY/ml卵黄，天津医科大学硕士学位论文纯度94．l％。经SDSPAGE分析，盐析法纯化IgY蛋白带清晰。总之正丁醇去脂是一种快速、简便、有效的纯化IgY的方法。本文应用蛋黄正丁醇去脂获得的抗T4－IgY建立了放免检测方法，对抗－ T4 IgY的质量进行鉴定：抗体滴度为 1：2500，工作浓度在 1：2500至 1：5000范围内；与 T3的交叉反应为 1．28％；亲和常数为 2．13 X 109L／m＊。这些合乎放免测定所需要的要求。方法学考核数据如下：最小检出量为 1石7ng／ml；批内平均变异系数为 5．3％，批间平均变异系数为 7．0％；平均回收率为96．13％。用本法与临床实验室应用的IgG－RIA法同时测定20例标本后进行配对t检验，两种方法测定结果差别无显著性，呈显著正相关（po．9988）。本文制备的IgY用于放免测定临床标本能很好地区分甲亢、甲低和正常人群。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R392

【参考文献】