人IL-2信号肽基因增强柯萨奇B3病毒VP1DA疫苗诱导的中和抗体应答

发布时间：2020-07-15 23:06

【摘要】： 目的：柯萨奇B组病毒（CVB）,共有6个血清型（CVB1～CVB6），是人类病毒性心肌炎的主要病原体，目前尚无有效的病毒特异性防治措施来保护人类免受其危害。DNA疫苗的问世，为建立有效的预防方法提供了机会。VP1是CVB3主要的衣壳蛋白，含有几个T细胞和B细胞表位，抗原性强，可刺激机体产生保护性的中和抗体，故其编码基因成为CVB3 DNA疫苗最有希望的侯选基因。以VP1的DNA疫苗免疫小鼠后虽获得较高的保护率，但中和抗体效价却普遍偏低。其主要原因是DNA疫苗编码的VP1蛋白可在转染细胞中表达却不能从转染细胞中自主释放，因而不能有效激发抗体应答。信号肽可以把合成的蛋白质移向细胞膜并与细胞膜结合，然后把合成的蛋白质送出胞外；而且信号肽可在不同蛋白质间互通使用。因此，在VP1基因的5′端融合上某种蛋白质的信号肽基因可能会促进表达的VP1蛋白从转染细胞内分泌。人白细胞介素2（hIL-2）信号肽是由20个氨基酸组成的高度疏水性序列，在成熟hIL-2分泌过程中被信号肽酶切掉，切点在20位的Ser与21位的Ala之间。信号肽酶切割位点与疏水性区域的长度及切点下游的二级结构有关。本研究的目的就是将hIL-2信号肽及成熟hIL-2 N末端11个氨基酸残基的基因与CVB3 VP1的cDNA融合，并克隆至真核表达载体pcDNA3，构建分泌型重组真核表达质粒pcDNA3/sVP1； WP=4 免疫小鼠后，通过血清中和抗体效价及对致死量CVB3攻击的保护作用评价其免疫效力。方法：（1）采用重叠区基因扩增法，将hIL-2信号肽及成熟hIL-2 N末端11个氨基酸残基的基因（简称hIL-2信号肽基因）与CVB3 VP1的cDNA拼接在一起，并大量扩增。根据hIL-2基因序列及CVB3基因全序列设计并合成4条引物：hIL-2信号肽基因上游引物(primer 1)；hIL-2信号肽基因下游引物(primer 2)；VP1基因上游引物(primer 3)；VP1基因下游引物(primer 4)。primer 1和primer 4中分别引入HindⅢ和XhoⅠ的酶切识别序列；primer 2为搭桥引物，其5′端添加的18个碱基与VP1基因反意义链3′端碱基序列一致，故这18个碱基是hIL-2信号肽基因与VP1基因的重叠区。以pcDNA3/hIL-2为模板，用primer 1和primer 2扩增hIL-2信号肽及成熟hIL-2 N末端11个氨基酸残基的基因；从CVB3(Nancy株)的病毒液中提取病毒RNA，以primer 4为引物逆转录；以逆转录产物为模板，以primer 3和primer 4为引物进行PCR扩增VP1基因；以hIL-2信号肽cDNA和CVB3 RNA的逆转录产物为模板，以primer 1和primer 4为引物进行PCR，通过信号肽有意义链3′端与CVB3 RNA cDNA第一链的18个碱基的重叠区，将两模板拼接在一起并在PCR过程中得以大量扩增，获得分泌型VP1(sVP1) 的cDNA。（2）将sVP1 cDNA克隆至pGEM-T载体，构建pGEM-T/sVP1，转化感受态大肠杆菌(E.coli)DH5α，接种含氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）的2-YT琼脂平板进行筛选，用HindⅢ和XhoⅠ双酶切鉴定后测序。（3）用HindⅢ和XhoⅠ切割pGEM-T/sVP1，然 WP=5 后将切下的sVP1 cDNA亚克隆至真核表达载体pcDNA3，构建分泌型重组真核表达质粒pcDNA3/sVP1；转化感受态菌DH5α后，接种抗生素（Amp）平板进行筛选，用HindⅢ和XhoⅠ双酶切鉴定。（4）用碱裂解法从转化的E.coli DH5α中大量提取分泌型重组真核表达质粒pcDNA3/sVP1及对照质粒pcDNA3/VP1和pcDNA3，用聚乙二醇（PEG）沉淀法进行纯化。（5）动物实验：将4～6周龄雄性BALB/c小鼠随机分为4组，每组20只；4组分别为生理盐水对照组、空质粒对照组（pcDNA3组）、pcDNA3/VP1对照组及pcDNA3/sVP1组。纯化后的质粒以生理盐水稀释后，股四头肌注射免疫小鼠，每次每只接种100μg，每2周免疫1次，共免疫3次；每次免疫后第14天，断尾取血，分离血清，用微量中和试验（固定病毒-稀释血清法）检测血清中CVB3特异性中和抗体的效价。第3次免疫后2周，用1000TCID50 的CVB3腹腔内攻击，观察并记录小鼠死亡情况至感染后第21天。结果：（1）构建了分泌型重组真核表达质粒pcDNA3/sVP1，插入的sVP1 cDNA的长度符合961bp的预期值，经测序，证明与报导的CVB3 VP1基因序列、hIL-2信号肽基因序列及成熟IL-2 N端11个氨基酸的基因序列一致。（2）各次免疫后中和抗体的平均效价：pcDNA3/sVP1组分别为1:9.33, 1:24.62, 1:27.32； pcDNA3/VP1组为1:7.85, 1:9.01, 1:9.66； pcDNA3组及生理盐水对照组各次免疫后中和抗体效价均小于1:5。对pcDNA3/sVP1第3次免疫后的平均中和抗体效价及pcDNA3/VP1第3次免疫后的平均中和抗体效价进行成组设计两样本几何均数比较的 WP=6 t检验，P＜0.001，表明两种质粒的免疫效果有差别，pcDNA3/sVP1可比pcDNA3/VP1诱导BALB/c小鼠产生更高水平的中和抗体。（3）用1000TCID50的CVB3攻击小鼠，各组21天生存率分别为：pcDNA3/sVP1组25%；pcDNA3/VP1组20%；pcDNA3组5%；生理盐水组8%。pcDNA3/sVP1组21天生存率稍高于3个对照组，但经行×列表资料的x2检验，表明这种差异不显著（0.25P0.5）；用log-rank检验比较生理盐水对照组与pcDNA3/sVP1组的生存曲线，及比较pcDNA3/VP1对照组与pcDNA3/sVP1组的生存曲线，均无显著性差异（0.25＜P＜0.5）。结论：（1）本研究成功地将VP1基因融合到hIL-2信号肽基因的3′端
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R392

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