抗恶性疟原虫HRP-II单链抗体库的构建、筛选

发布时间：2020-07-19 22:38

【摘要】： 疟疾（malaria）是广泛流行于热带、亚热带甚至温带边缘的一种重要虫媒传染病，严重地威胁着人类的健康。疟疾疫情虽然曾得到较好的控制，但近几年又有回升趋势，切实可行的预防、诊断、治疗工作迫在眉睫。噬菌体抗体库技术为基因工程抗体的研究开辟了新的领域，各种小分子抗体（特别是人源性小分子抗体）应运而生，并在感染性疾病的诊断与防治、自身免疫性疾病与病毒性疾病的鉴别研究、肿瘤的影像分析和导向治疗或基因治疗（细胞内免疫）等多个领域展示出巨大的潜能和广阔的应用前景。该技术与传统的杂交瘤技术制备抗体相比，具有简单易行、生产成本低、筛选容量大、可通过发酵大量制备且可绕过细胞杂交（甚至可不经过免疫）等优点。本研究采用噬菌体抗体库这一新兴的生物学技术，用HRP-Ⅱ-β 半乳糖苷酶融合蛋白免疫小鼠，取其脾细胞提取mRNA，经逆转录PCR 扩增出抗体重链和轻链可变区基因库，大小分别为340bp和300bP左右，纯化回收的V_H与V_L在接近等摩尔浓度下，用重叠延伸拼接法以Linker 相连组装成单链抗体基因（ScFv），再用带限制性内切酶位点的引物（5’ 端SfiⅠ，3’端NotⅠ）扩增ScFv基因片段，获得大小约750bp的目的片段，纯化后分别用SfiⅠ和NotⅠ消化，与SfiⅠ/NotⅠ双酶切的载体pCANTAB 5E连接，化学法转化大肠杆菌TG1感受态细胞，转化率为3.3×10~6/μg DNA。转化菌经辅助噬菌体M13K07援救后，得到库容约为1.2×10~6的中等大小的噬菌体抗体库。经质粒和PCR初步鉴定，证明有外源片段插入且其大小与目的片段一致，连接率为60％。在成功构建抗HRP-Ⅱ噬菌体抗体库的基础上，我们以HRP-Ⅱ为靶抗原对噬菌体抗体库进行了三轮“吸附-扩增-援救”的富集过程，从而得到了抗HRP-Ⅱ的次级噬菌体抗体库（滴度为4.2×10~8cfu/ml）。用富集后的库液铺板并挑取单菌落制备噬菌体抗体，分别用HRP-Ⅱ-β半乳糖苦酶融合蛋白和β-半乳糖苷酶筛选，以单纯抗HRP-Ⅱ-β半乳糖苷第一军医大学硕士学位论文酶融合蛋白阳性的克隆为抗HRP－11的阳性克隆，共得到8个阳性克隆株。选阳性反应较强的95号和63号菌株进行抗体的可溶性诱导表达并作进一步的鉴定，所表达的单链抗体分子量大小约为30kD左右，能与重组HRP－11抗原起特异性免疫反应，以培养上清中的抗体活性为最佳。通过对诱导表达条件的优化，发现以 OD。；，；；＝0．8、IPTG终浓度 0．2 mM、诱导温度30＊、诱导时间20小时为最优化条件。以最优化条件摇瓶培养1000 ml制备目的抗体，超滤浓缩后用饱和硫酸铰分步沉淀法（50％， 70％）加阴离子交换柱分离纯化目的抗体，获得浓度为 0．93ms／L，纯度为42．8％的抗 HRP－11单链抗体。测序结果表明插入片段完全，SJV为 749hp，与理论值相符，DNA及氨基酸序列同源性比较结果表明，该序列属于鼠源抗体SCFV序列，其人及V。分别属于鼠重链可变区第1亚群及K链第IV亚群。上述结果表明，用噬菌体抗体库技术制备单链抗体简便、高效，所获抗HRP－11单链抗体能与靶抗原起特异性免疫反应，具有作为免疫诊断试剂的潜质，为基因工程抗体的广泛应用奠定了基础。
【学位授予单位】：第一军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2001
【分类号】：R392-33

【引证文献】